微生物实验预习报告..doc

实验三 细菌革兰氏染色法及芽孢染色法 一、实验目的 1. 初步掌握细菌涂片方法及革兰氏染色的步骤； 2. 掌握细菌芽孢染色的方法。 二、实验内容 1. 制作细菌染色装片。 2. 进行革兰氏染色法操作。 三、实验材料和用具 大肠杆菌(E．coli)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)菌液，枯草芽抱杆菌(Bacillus subtilis)的斜面菌种。 革兰氏染色液(结晶紫染液、卢戈氏碘液、95％乙醇、石炭酸复红液等)、香柏油、二甲苯和5％孔雀绿水溶液。 显微镜、擦镜纸、接种环、载玻片、吸水纸、试管、小滴管、酒精灯和烧杯。 四、操作步骤 (一) 革兰氏染色 1．涂菌 用无菌操作方法从试管中沾取菌液一环，用接种环在洁净无脂的载玻片上做一薄而匀、直径约1cm的菌膜。涂菌后将接种环火焰灭菌。 2. 干燥 于空气中自然干燥。亦可把玻片置于火焰上部略加温加速干燥(温度不宜过高)。 3．固定 目的是杀死细菌并使细菌粘附在玻片上，便于染料着色，常用加热法．即将细菌涂片向上，通过火焰3次，以热而不烫为宜，防止茵体烧焦、变形。此制片可用于染色。 4. 初染 于制片上滴加结晶紫染液，染1min后，用水洗去剩余染料。 5. 媒染 滴加卢戈氏碘液，1min后水洗。 6. 脱色 滴加95％乙醇脱色，摇动玻片至紫色不再为乙醇脱退为止(根据涂片之厚薄需时30s至1min水洗。 7. 复染 滴加石炭酸复红液复染1min，水洗。 8．用滤纸吸干,油镜镜检。 (二)芽孢染色法 1．方法1 (1) 取37℃培养18-24h的枯草芽孢杆菌作涂片，并干燥，固定(参见“细胞单染色法”) 。 (2) 于载片上滴人3—5滴5％孔雀绿水溶液。 (3) 用试管夹夹住载玻片在火焰上用微火加热，自载玻片上出现蒸汽时开始计算时间约4-5min。加热过程中切勿使染料蒸干，必要时可添加少许染料。 (4) 倾去染液，待玻片冷却后，用自来水冲洗至孔雀绿不再褪色为止。 (5) 用0.5％沙黄水溶液(或o．05％碱性复红)复染1min，水洗。 (6) 制片干燥后用油镜观察。芽孢呈绿色，菌体红色。 2．方法2 (1) 加1-2滴自来水于小试管中，用接种环从斜面上挑取2—3环培养18—24h的枯草芽孢杆菌菌苔于试管中，并充分期匀打散，制成浓稠的菌液。 (2) 加5％孔雀绿水溶液2—3滴于小试管中．用接种环搅拌使染料与菌液充分混合。 (3) 将此试管浸干沸水浴(烧杯)中，加热15—20min。 (4) 用接种环从试管底部挑数环菌于洁净的载玻片上，并涂成薄膜，将涂片通过微火3次固定。 (5) 水洗，至流出的水中无孔雀绿颜色为比。 (6) 加沙黄水溶液，染2—3min后，倾去染液，不用水洗。 (7) 干燥后用油镜观察。芽孢绿色，菌体红色。 (三) 结果 革兰氏阳性菌染成蓝紫色, 革兰氏阳性菌染成淡红色。 (四) 检测未知菌 用以上方法对未知菌进行革兰氏染色呵芽孢染色，并绘图、记录染色结果。 五、注意事项 1．涂片务求均匀．切忌过厚。 2．在染色过程中，不可使染液干涸。 3．脱色时间十分重要，过长，则脱色过度，会使阳性菌被染成阴性菌。 4．老龄菌因体内核酸减少，会使阳性菌被染成阴性菌，故不能选用。 5．供芽孢染色用的菌种应控制菌龄，使大部分芽泡仍保留在菌体上为宜。 六、演示 1. 无菌操作取菌、涂片及涂片的固定； 2. 制片方法及染色过程。 七、实验报告 (一) 绘图 大肠杆菌革兰氏染色视野图； 金黄色葡萄球菌革兰氏染色视野图； 枯草芽孢杆菌及巨大芽孢杆菌的菌体及芽孢形态，芽孢的着生位置。 (二) 记录革兰氏染色法步骤，并进行结果分析。 (三) 未知菌的检测结果。 七、问题和思考 1．涂片后为什么要进行固定，固定时应注意什么? 2. 什么是革兰氏染色法?染色过程应注意什么? 3. 试分析革兰氏染色法在细菌分类中的意义。 4. 为什么芽孢染色要加热?为什么芽孢及营养体能染成不同的颜色? 实验四 油镜的使用和细菌形态的观察 一、 实验目的 复习显微镜低倍镜和高倍镜的使用技术．了解油浸系物镜的基本原理，掌握油浸的使用方法。 二、实验内容： 1．学习油浸系物镜的使用方法。 2．用油镜观察枯草芽抱杆菌和金黄色葡萄球菌染色装片。 三、实验材料和用具 枯草芽孢杆菌(Bacillus .subtilis)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的染色装片。 香柏油、二甲苯、 显微镜、擦镜纸 。 四、操作步骤 (一) 观察前的准备 1．将显微镜置于平稳的实验台上，镜座距实验台边沿约为4cm。坐正，练习用左眼观察。 2．调节光源：将低倍物镜转到工作位置，把光圈完全打开，聚光器升至与载物台相