微生物生理生化实验报告..doc

实验十 一 IMViC与硫化氢试验 指导教师：李海花 周六 第三组 学号：060122010041? 姓名：宋天佳? 专业：2010级水产养殖 ? 学号：030212010025 姓名：皇 昊 ? 专业：2010级化学1班 学号：060122010055 姓名：续鹏辉 专业：2010级水产养殖 一、实验目的 了解IMViC与硫化氢反应的原理及其在肠道菌鉴定中的意义和方法。 二、实验原理 IMViC是I－吲哚（indol test）、M－甲基红（methyl red test）、V－伏-普（Voges-Prolauer test）和C－柠檬酸盐（citrate test）4个实验的缩写。这4个实验主要用来快速鉴别产气杆菌与大肠杆菌，多用于水的细菌检查。大肠杆菌虽非致病菌，但在饮用水时若超过一定指标，则表示水质受粪便污染。产气杆菌也广泛存在于自然界中，因此检查水是要将两者分开。硫化氢（H2S）实验也是检查肠道细菌的生化实验。 （一）吲哚试验（indol test） 吲哚试验是用来检测吲哚试验的产生，有些细菌分解培养基中的色氨酸生成吲哚（靛基质），经与试剂中的对二甲基氨基苯甲醛作用，生成玫瑰吲哚而呈红色。 色氨酸＋H2O色氨酸酶 吲哚＋NH3＋丙酮酸 吲哚+ 对二甲基氨基苯甲醛 玫瑰吲哚（红色） 只有部分细菌能产生色氨酸酶，从而具有分解色氨酸产生吲哚的能力，因此吲哚实验可以作为一个生化检测指标。大肠杆菌产色氨酸酶实验结果为阳性（红色），产气肠杆菌不产色氨酸酶实验结果为阴性（无色）。 （二）M-甲基红试验（methyl red test） 用来检测由葡萄糖产生的有机酸，如甲酸、乙酸、乳酸等。细菌代谢糖产生酸使培养基变酸（pH下降），使甲基红指示剂变色：橘黄色（pH6.3） 红色（pH4.2） 尽管，所有肠道微生物都能发酵葡萄糖产生有机酸，但大肠杆菌和产气肠杆菌有区别： 两者在培养早期产生有机酸，但大肠杆菌在培养后仍能维持酸性pH4，而产气肠杆菌则将有机酸转化为非酸性产物，使pH上升至6左右。因此，大肠杆菌为阳性（红色），产气肠杆菌阴性（黄色）。 （三）伏-普实验（Voges-Prolauer test） 测定细菌利用葡萄糖产生非酸性或中性末端产物（如丙酮酸）的能力。丙酮酸进行缩合、脱羧生成乙酰甲基醇，此化合物在碱性条件下能被空气中的氧气氧化成二乙酰。二乙酰与蛋白胨中的精氨酸的胍基作用，生成红色化合物，及伏-普反应阳性，不产生红色化合物者为反应阴性。碱性条件、加入少量含胍基的化合物可使反应更明显。 大肠杆菌不产丙酮酸实验结果为阴性（无色），产气肠杆菌产丙酮酸实验结果为阳性（红色）。 葡萄糖 丙酮酸-CO2缩合 乙酰乳酸 -CO2脱羧 乙酰甲基甲醇 +OH--2H 胍基+二乙酰 红色化合物 （四）柠檬酸盐试验（citrate test） 用来检测柠檬酸盐是否被利用，有些细菌以柠檬酸钠为碳源，培养基中的柠檬酸和磷酸铵被分解后，产生碱性化合物，使pH升高，当加入1％溴麝香草酚蓝指示剂时，培养基就会有绿色转变为深蓝色，溴麝香草酚蓝指示范围：pH＜6黄色，pH 6～7绿色，pH ＞7 蓝色。大肠杆菌不能利用柠檬酸盐实验结果为阴性（绿色），产气肠杆菌能利用柠檬酸盐实验结果为阳性（蓝色）。 （五）硫化氢实验 用来检测硫化氢的产生，也是用于肠道细菌检查的常用生化实验。含硫有机物（如胱氨酸、半胱氨酸、甲硫氨酸）能被部分细菌分解产生H2S， H2S和培养基中的铅盐或铁盐反应，形成黑色的硫化铅或硫化铁沉淀。大肠杆菌不能分解含硫有机物实验结果为阴性（无沉淀），产气肠杆菌能分解含硫有机物实验结果为阳性（黑色沉淀）。 三、实验器材 1、菌种：大肠杆菌、产气肠杆菌斜面各一支。 2、培养基 ：蛋白胨水培养基、葡萄糖蛋白胨水培养基、柠檬酸盐培养基、硝酸盐还原培养基、醋酸铅培养基 3、溶液和试剂：甲基红指示剂，40％KOH，5％-萘酚溶液，乙醚，吲哚试剂 4、仪器或其他用具： 试管架，接种环等 四、操作步骤 一）实验准备 1.葡萄糖蛋白胨水培养基配制：蛋白胨3g，葡萄糖3g，磷酸氢二钾1.2g，水600ml，溶解，调节Ph7.，0-7.2，分装于70支试管中，112℃灭菌30min。 2.柠檬酸盐培养基配制：NH4H2PO40.2g，K2HPO4 0.2g，NaCl1g，MgSO4 40mg，柠檬酸钠0.4g，琼脂4g，调节pH6.8，1%溴香草酚蓝乙醇液2ml，水200ml，溶解，分装于20支试管中， 121℃灭菌20min。（pH不宜偏高，以淡绿色为宜） 3. 硝酸盐还原培养基配制：蛋白胨1.25g，氯化钠0