微生物肥料宁盾在白芍田间试验Protocol..doc

白芍田间试验protocol 1 实验目的及意义 白芍为常见中药材之一，年需求量在1万吨之上，在种植过程中常有灰霉病发生，造成减产，另外，生长周期长也是制约其产业快速发展的重要因素，一般需种植4－6年才能收获，如何实现中药白芍的高产优质是本试验的主要目的。 （1）通过田间试验分析生防菌剂“宁盾”对白芍的促生以及防病效果； （2）分析生防菌剂“宁盾”的施用对白芍根围微生态的影响； （3）分析生防菌剂“宁盾”的施用对白芍品质的影响。 实验假设：生防菌剂“宁盾”的施用能在一定程度上促进白芍的生长，包括根系更长、更粗壮，分支更多等；在有病害压力的情况下还能起到一定的防病效果；生防菌剂“宁盾”的施用能改变白芍的根围微生态，增加有益菌的种类和数量；在提高产量的同时，还能保证白芍的质量，表现为有效成分含量增加。 2 实验材料 2.1实验对象 白芍（由江苏省句容市天王镇金山中药材种植基地提供） 2.2 实验药剂 生防试验菌剂——“宁盾”，由南京农大生物源农药创制有限公司提供。 生防菌剂对照品——木霉菌肥效剂，由山东省科学院生物研究所研制提供。 试验菌剂——“宁盾”共设4个浓度梯度： A.25倍稀释液（浓度：8×106CFU/mL）； B.50倍稀释液（浓度：4×106CFU/mL）； C.100倍稀释液（浓度：2×106CFU/mL）； D.150倍稀释液（浓度：1.3×106CFU/mL）； E.生防菌剂对照品——木霉菌肥效剂400倍稀释液（浓度：5×105CFU/g） F.化学对照（50%多菌灵800-1000倍液）； G.清水对照。 3 实验方法 3.1 生长指标及产量测定 11月初，选其形状粗大，芽头饱满的，纵切成数块，每块带有粗壮的芽苞2-3个，供种苗用。处理组用生防菌剂“宁盾”30倍稀释液浸泡5 min；生防菌剂对照组用木霉菌肥效剂200倍稀释液浸泡5 min；化学对照用50%多菌灵800倍液浸泡5 min；清水对照组用清水代替。晾干备用。 按行株距50 cm×40 cm挖穴，芽头向上，埋入穴内，覆土4 cm左右，每亩种植2500-3000株（约4株/m2），用种秧约100 Kg。试验共有7个处理，每个处理3个重复，每个重复30m2，约120株苗，栽后处理组用生防菌剂“宁盾”的稀释液（25倍、50倍、100倍、150倍）灌于根部，每株用量约150mL；生防菌剂对照组用木霉菌肥效剂400倍稀释液灌于根部；化学对照组用白芍生产上的常规药剂进行防治（发病初期喷50%多菌灵800-1000倍液，或50%托布津1000-1500倍液，每隔10天1次，连喷2-3次。），对照用清水代替。第2-4年，每年4、7、10月各处理1次，并对株高、茎粗、分枝数等生长指标进行检测。株高为植株水平位至高点到茎基部地面的距离；茎粗统一按近地面5cm进行测量；分枝数按一级分枝计算。采用5点取样法，自每个重复中随机选择50株进行测量。第4年10月底采收，统计各处理组白芍根皮的产量，计算增产效果。 3.2 防病效果统计 白芍收获时，采用五点取样法，每点选取10株，根据灰霉病的病害分级标准统计病情指数，并计算病害严重度，分析各处理组的防治效果。 病害分级标准： 0级：无病斑； l级：病斑占叶面积的5%以下； 3级：病斑占叶面积的6~15%； 5级：病斑占叶面积的16~25%； 7级：病斑占叶面积的26一50%； 9级：病斑占叶面积的50%以上(或叶柄折断)。 . 病害严重度 (%)=∑ (各级病叶数 × 相应级数值)/调查总叶数 × 最高级数值× 100% 防治效果 (%)= ( 对照病害严重度 - 处理病害严重度 ) / 对照病害严重度 × 100 % 3.3通过变性梯度凝胶电泳（denaturing gradient gel electrophoresis，DGGE）检测“宁盾”处理对白芍根围微生物群落的影响 3.3.1 土壤样品的采集 在“宁盾”施用前、施用0天、3天、10天、30天、60天、收获时对所有处理（包括对照）分别取样。每个处理取3个重复的样品，每个重复采用5点取样（5个点在取样范围内尽量分散）。取样时，将植株根部的土轻轻抖落，去掉大块土壤，将须根及粘附在须根上的土壤一起装入纸袋并贴上标签。最终用于检测的根围土样品包括根系以及紧紧附着于根系上的土壤。 （采样时应记录以下信息：白芍的播种期，取样期，白芍的品种，以及施用过的药剂、肥料，并画下采样示意图。尽可能的记录土壤类型，样地经纬度，海拔高度等数据。） 3.3.2 土壤总DNA的提取 采集的根围土样品带回实验室迅速处理，首先所有样品2 mm过筛。然后分别取0.5 g 样品根据说明采用Fast DNA Spin Kit for S