微生物自主实验报告..docx

微生物自主实验报告涂平板分离土壤中的微生物，选用的菌株 图一 图二第二种菌：乳白第一种菌：亮黄显微镜下观察的细菌形态芽孢染色、革兰氏染色细菌的生理生化反应酚红半固体（左为亮黄的实验结果、右为乳白的实验结果）空白对照组糖酵解实验菌：亮黄（培养基从左至右依次为：乳糖、蔗糖、葡萄糖）实验菌：乳白（培养基从左至右依次为：葡萄糖、蔗糖、乳糖，其中有封口膜的为实验组，无封口膜的为对照组）细菌总DNA提取、凝胶电泳检测实验原理：DNA在生物体内是与蛋白质形成复合物的形式存在的，因此提取出脱氧核糖核蛋白复合物后，必须将其中蛋白质去除。实验中，溶酶菌可以破坏细菌的细胞壁，10%SDS可以破坏细菌细胞膜，氯仿：异戊醇可以使蛋白质变性，最后用乙醇沉淀DNA。?DNA的电泳原理与蛋白质的电泳原理基本相同。DNA分子在高于其等电点的pH溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。由于DNA分子或DNA片断的分子量差别，电泳后呈现迁移位置的差异。实验材料和方法：材料：1、菌种 E. coli2、试剂 TE 溶菌酶溶液（0.15mol/l Nacl, 0.1mol/l Na2EDTA, 15mg/ml溶菌酶，pH=8） 10% SDS （0.1mol/l Nacl，0.5mol/l Tris，10%SDS，pH=8） 酚:氯仿:异戊醇(25:24:1) 乙醇3. 仪器 高速台式离心机、紫外检测仪4. 其他材料：离心管、无菌吸头 、移液器等实验方法：（一）革兰氏阴性菌总DNA提取方法 (本实验所用菌株经革兰氏染色呈阴性) 1. 0.9ml 细菌培养液, 6000rpm离心2分钟, 弃上清, 加0.9ml溶菌酶溶液悬混. 2. 37℃温浴20 min 3. 加0.9ml 10%SDS，反复颠倒混匀5 min，10000r/min离心10min，取上清，分至两管（~0.7ml） 4. 加等体积苯酚：氯仿：异戊醇，混匀5 min，水相移至新管 5. 加40μl的3mol/l乙酸钠和3ml无水乙醇，-20℃沉淀DNA10 min，12000r/min 离心10min，弃上清 6.轻轻加70%乙醇，置2min，弃乙醇，静置待乙醇挥发干净（~20 min） 7. 加100μl TE溶解DNA（二）DNA的琼脂糖凝胶电泳 1、1g 琼脂糖加入100ml 1×TAE电泳缓冲液中，摇匀，微波炉加热溶解。2、将冷却至50℃的凝胶倒入制胶室，插入梳子，室温冷却凝固3、将凝胶置入电泳槽中，加1×TAE电泳缓冲液至液面覆盖凝胶1-2mm，小心垂直向上拔出梳子4、用移液器吸取总DNA 4μl于封口膜上，再加入1μl 的6X载样缓冲液，混匀后，小心加入点样孔 5、打开电源开关，调节电压至3-5V/cm，可见到溴酚蓝条带由负极向正极移动，电泳约30min-60min6、电泳结束后取出凝胶，置EB 溶液中染色5~10min，清水漂洗7、将染色后的凝胶置于紫外透射检测仪上，盖上防护观察罩，打开紫外灯，可见到发出荧光的DNA条带实验结果：我们的实验组为4、5、6，其中第四、五组的荧光效果较强，说明DNA浓度足够大。分析讨论：本实验提取到的总DNA通过电泳分析证明DNA含量水平合适，可以用于PCR实验。琼脂糖是一种天然聚合长链状分子，可以形成具有刚性的滤孔，凝胶孔径的大小决定于琼脂糖的浓度?。DNA分子在碱性缓冲液中带负电荷，在外加电场作用下向正极泳动。DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时，有电荷效应与分子筛效应。不同DNA的分子量大小及构型不同，电泳时的泳动率就不同，从而分出不同的区带?。实验菌是革兰氏阴性菌，其细胞壁薄、肽聚糖含量低。经过溶菌酶处理后，肽聚糖的1，4-糖苷键断裂，细胞壁裂开，同时经过阴离子去污剂SDS处理，使细胞膜崩解，从而达到菌体的充分的裂解。在有机溶剂（酚、氯仿）存在时，核酸结合蛋白会发生变性，从核酸分子上解离下来，而由于核酸分子携带有大量负电荷，极性较强，当体系分相时会保留在水相中。在实验过程中，由于细菌裂解后受到剪切力或核酸降解酶的作用，染色体DNA容易被切断成为各种大小不同的碎片而与质粒DNA共同存在，因此，采用乙醇沉淀法得到的DNA除含有质粒DNA外，还可能有少部分染色体DNA和RNA，经过电泳扩散后，RNA的扩散速度比较快，故会出现在条带最前端，总DNA由于扩散速度慢，离点样孔较近的地方分布较多。?本次试验中，要注意离心管不可剧烈震动，防止过多断裂，在用移液器吸取DNA溶液时，也可以将枪头稍微用剪刀剪大一些，保护DNA防止其断裂；同时，加入有机溶剂分层后，要注意吸取上层水层。6