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总结了测序中经常遇到的问题及原因分析，希望对大家有帮助！Q:测序结果中为什么找不到引物序列? A:找不到用来测序的引物，这是正常的，因为测序的方法是荧光标记测序法，仪器通过检测 ddNTP 上的荧光来读取所测序列，而引物本身是不被标记的，所以仪器无法检测到； 找不到所测片段的扩增引物，这种情况是因为您所采用的酶切位点离所用的测序引物距离太近，一般荧光燃料会干扰几十个碱基的读取，这部分碱基会损失掉，损失掉的序列很可能就包含引物的序列，所以引物的序列无法找到； 测出的引物序列是原引物序列的反向互补序列，这是因为 TA 克隆的插入没有方向性，如果插入片段是相反的，这时就要反向互补查找引物； 测出的结果为空载体，这是因为由于某种原因导致质粒上没有插入外源片段，这时所测的为载体序列，所以就找不到引物了； 存在单引物扩增，有一条引物的特异性不好，有多个结合位点，导致只有一条引物参与扩增。 Q:为什么测序结果中引物的序列有个别碱基不同了? A: 这是因为引物区同样存在错配的可能，出现这种可能性有两种: 合成错误和引物区有错配 我们可以挑选同批次 2个以上的克隆进行测序验证，如果结果完全相同，应该是合成错误；如果在引物的相同位置错误的碱基不一样那就应该是引物区有错配。 Q:哪些引物不适合作为测序引物? A:①兼并引物：简并引物要在测序模板上有多个结合位点，直接影响测序结果； ②随机引物：如 RAPD 引物，随机引物一般都比较短，所用退火温度低，在测序反应的条件下，不能很好地与模板结合； ③过长的引物：一般要求测序引物不大于 24bp，过长的引物在测序反应的较低的条件下容易在测序模板上有多个结合位点，导致测序结果背景增高。另外，较长的引物纯度也将难以保证。通常用于测序的引物纯度要在 90%以上，引物纯度低时，测序反应的背景将明显增大，直接影响到测序结果； ④有特殊标记的引物：该情况主要指荧光标记的引物。我们测序反应的四种碱基都是荧光标记的，这样，荧光标记的引物将产生干扰。另外，其他一些有大的标记基团的引物也最好不要用于测序。引物上大的标记基团将直接影响到 DNA 片段的迁移率，导致测序结果峰型不好或错误； ⑤不纯的引物：测序引物对纯度的要求很高，合成的引物中非全长的片段可以造成较强的背景。测序的引物最好是经过 PAGE 胶纯化的。 Q: 用测序的方法检测点突变可靠吗？ A: 该方法可靠性不高，主要有以下两个原因。 ①首先，并不清楚突变的序列与正常的序列的比例是多少。测序反应的信号强度直接与模板的量有关，如果突变的模板所占的比例很少，将直接作为背景噪音了，很难检测出来。只有当测序反应体系中正常的和突变的模板量比较接近时，才能较可靠地检测到突变体的存在； ②其次，在同一位置，不同碱基的信号强渡一般是不一样的。这样即使突变的模板所占的比例较高时，也不一定能准确检测到突变的存在。另外，测序仪是设计用来测序正常的碱基序列的，软件在对扫描的结果进行处理时， 会尽量提高主峰而将背景信号尽量压低， 以得到尽可能好的结果。 因此， 当某处出现双峰时，测序仪一般会认为信号弱的峰为背景信号，在处理过程中，将弱的峰进一步压低，这样根部不立于突变体的检测。因此认为，用测序的方法检测突变体的存在不是一个好的方法。 QNA测序样品用什么溶液溶解比较好? A:溶解DNA测序样品，用灭菌双蒸馏水最好。DNA 的测序反应也是 Taq酶的聚合反应，需要一个最佳的酶的反应条件。用缓冲液溶解在进行测序反应时，缓冲液的组份会影响到测序反应，条件，造成 Taq 酶的聚合性能下降。 Q:测序结果中会出现双峰的现象，是什么原因造成的? A:样品本身被污染，这常常发生在样品为质粒和菌液的情况中。当使用通用引物测序时，如果刚好和样品中的几个质粒均能结合，那么就会出现这种情况，而且在同一位置上还可能有不止两个峰形； 样品不是单一模板，这常常发生在样品为PCR产物的情况中。由于使用的是特异性引物，因此即使模板中有其他 DNA 的存在，产生干扰的可能性也很小。通常是由于存在两条分子量很接近，采用琼脂糖电泳无法分开的条带，在测序时就会发生这种情况； 样品中存在两个引物结合位点，这常常发生在样品中存在重复序列的情况下。当引物恰好设计在重复序列中时，那么在重复序列以外的部分就会出现 Two pattern 的情况； 所用的测序引物不纯， 这种情况一般发生在PCR产物测序中。 因为PCR测序一般使用的都是PCR扩增引物，如果引物本身不纯，测序结果会出现双峰。所以我们测序的引物一般要求都是要经过 PAGE 纯化的； 测序样品序列中存在如重复序列，poly 结构，发夹结构等复杂结构导致测序信号出现乱峰。 QNA