手足口病RT-PCR检测标准操作程序_TianGen_1_2..doc

手足口病RT-PCR检测标准操作程序_TianGen_1_2..doc

  1. 1、本文档共5页,可阅读全部内容。
  2. 2、有哪些信誉好的足球投注网站(book118)网站文档一经付费(服务费),不意味着购买了该文档的版权,仅供个人/单位学习、研究之用,不得用于商业用途,未经授权,严禁复制、发行、汇编、翻译或者网络传播等,侵权必究。
  3. 3、本站所有内容均由合作方或网友上传,本站不对文档的完整性、权威性及其观点立场正确性做任何保证或承诺!文档内容仅供研究参考,付费前请自行鉴别。如您付费,意味着您自己接受本站规则且自行承担风险,本站不退款、不进行额外附加服务;查看《如何避免下载的几个坑》。如果您已付费下载过本站文档,您可以点击 这里二次下载
  4. 4、如文档侵犯商业秘密、侵犯著作权、侵犯人身权等,请点击“版权申诉”(推荐),也可以打举报电话:400-050-0827(电话支持时间:9:00-18:30)。
查看更多
手足口病RT-PCR检测标准操作程序_TianGen_1_2.

手足口病RT-PCR检测标准操作程序(200年月日第1版) 标准编号:检测项目: 检测方法: PCR PCR仪器: Bio-Rad iCycler 检测原理 ’-UTR区基因序列及EV71、CA16的VP1-VP3基因序列,设计特异性引物(PE、EV71、CA16),通过Nested RT-PCR扩增基因片段,检测标本中是否存在肠道病毒EV71、CA16和其他肠道病毒。所用引物序列、扩增产物大小和配制如下: 引物 核酸序列(5’–3’) 产物长度 加DEPC水量(uL) (1 OD配制25 uM) PE2 TCC GGC CCC TGA ATG CGG CTA ATC C 116 bp 156 PE1 ACA CGG ACA CCC AAA GTA GTC GGT CC 180 EV71-S GCA GCC CAA AAG AAC TTC AC 226 bp 196 EV71-A ATT TCA GCA GCT TGG AGT GC 208 CA16-S ATT GGT GCT CCC ACT ACA GC 208 bp 220 CA16-A TCA GTG TTG GCA GCT GTA GG 208 应用的范围 标本处理3.1 粪便标本处理: 1.5ml Eppendorf管上标记标本号; 3.1.2每一管中加入900ul生理盐水、100ul 氯仿; 3.1.3在生物安全柜中将每一份粪便标本取大约0.1g约绿豆大小,加入标记好的离心管中,剩余原始标本最好留在原容器中并冻存于 - 20℃。 3.1.4 确保拧紧离心管,用机械振荡器剧烈振荡20min。 1500g* (约3500转)离心20分钟。 3.1.6 将每一份标本上清吸入新1.5ml Eppendorf管中。 注意:若上清不清澈,应再用氯仿处理一次。以上标本处理方法适用于从患者排泄物、呕吐物(均简称样品)中提取病毒RNA。 3.2咽拭子标本处理 咽拭子要在保存液中充分搅动(40下左右)或用机械振荡器剧烈振荡5~10min,以洗下拭子上粘附的病毒及含有病毒的细胞等,然后10000rpm 离心20min或4℃静置10min, 取上清吸入2个有外螺旋盖的标记好的冻存管中。 注意:以上标本处理方法适用于从疱疹液拭子、肛拭子(均简称样品)中提取病毒RNA。脑脊液、血清标本不需要处理可直接用于RNA提取。 3.3 提取病毒RNA模板 应用RNA提取试剂盒(GEN公司产品,Cat. No:)方法 nase-free ddH2O加入310ug Carrier RNA获得1 ug/uL的溶液。溶解后需分装保存于-20℃。(每管分装56uL可做10次提取)。此溶液反复冻融不能超过3次。 b Carrier RNA工作液配置:根据样品的数量计算所需裂解液RL和Carrier RNA溶液的体积,将裂解液RL与Carrier RNA溶液颠倒混匀,即得到Carrier RNA工作液。为避免溶液出现气泡现象,请勿使用涡旋振荡。   N × 0.56 mL=Y mL   Y mL × 10 uL/mL=Z uL N-样品数目;Y-裂解液RL溶液体积;Z-需加入Carrier RNA溶液体积 注意Carrier RNA冻干粉不能直接溶解于裂解液RL中,必须先溶解在Rnase-free ddH2O中,再溶解至裂解液RL中。溶解后2-8℃最多能保存48小时,最好现用现配。 c 缓冲液GD、漂洗液RW 为浓缩液,第一次使用前加入无水乙醇(试剂瓶上标注的量)混匀,室温可储存1年。 ----------------------------------------------------------------------------------------------------------------- 提取病毒RNA模板: 3.3.1 吸取560 μl 含有Carrier RNA的L到1.5ml Eppendorf离心管中。 加140 μl到上述离心管中,回旋振荡15秒。 室温(15~25℃)孵育10 min。 短暂离心一次。 加560 μl乙醇(96~100%)到离心管中,盖上离心管帽,回旋振荡15秒。短暂离心一次。 从离心管中吸取0 μl溶液至nase-free吸附柱CR2中,注意不要滴到柱子边缘上。盖上离心管帽,6000g(8000rpm)离心1 min。把重复第6步的步骤加500 μl 缓冲液,盖上离心管帽,6000g(8000rpm)离心1 min。把加500 μl,盖上离心管帽,6000g(8000rpm)离心1 min。把00g(1000rpm)离心3 min。把1.5ml 无RNA酶离心管打开柱子帽,加入60μlnase-free ddH2

文档评论(0)

dbtx + 关注
实名认证
内容提供者

该用户很懒,什么也没介绍

1亿VIP精品文档

相关文档