现代生物实验原理与技术考试整理..doc

蛋白质表达技术 DNA重组表达：在合适表达元件（如转录启动子、终止子、翻译调控序列、转录酶、翻译因子等）调控下，目的基因表达成目的蛋白质的技术。 外源基因在大肠杆菌中的表达： 大肠杆菌表达外源基因的优势： 1、全基因组测序，共有4405个开放型阅读框架 2、基因克隆表达系统成熟完善 3、繁殖迅速、培养简单、操作方便、遗传稳定 4、被美国FDA批准为安全的基因工程受体生物 大肠杆菌表达外源基因的劣势： 1、缺乏对真核生物蛋白质的复性功能 2、 缺乏对真核生物蛋白质的修饰加工系统 3、 内源性蛋白酶降解空间构象不正确的异源蛋白 4、 细胞周质内含有种类繁多的内毒素 大肠杆菌表达载体分类： 按蛋白质类型分： 单纯表达: pJLA系列, 用NcoI/NdeI导入AUG的载体 融合表达: 融合各种tag, GST, CBD, MAL, GFP, etc 分泌表达: pel/ompT分泌肽 按启动子分： lac及衍生的tac , trc, pac, rac等启动子 IPTG诱导 lamda phage PL和PR 启动子 热诱导 T7 启动子 IPTG诱导 T5 启动子 IPTG诱导 ara启动子 阿拉伯糖诱导 选择表达系统： 蛋白质的大小： 小的胞质蛋白和多肽最好能与运载序列连接，以融合蛋白的形式在大肠杆菌中表达。运载序列能起到稳定靶蛋白的作用，使其免受胞内蛋白酶的降解，并能提供用于亲和纯化的配基结合位点。用蛋白酶在融合蛋白的适当位置进行切割，可以回收有活性的靶蛋白。 2. 蛋白质的需要量： 如果需要少量的靶蛋白、酶的活性可以用粗提物来分析，一般不需要进行优化表达。 3. 蛋白质是否需要保留活性： （1）若只用于生产抗体，包涵体有利于分离。 （2）若靶蛋白用于生物化学或细胞生物学研究，就要考虑活性，其次考虑纯化问题。 （3）若要用于结构研究，最好能以可溶性状态表达。 外源基因在大肠杆菌中的表达： 外源基因在大肠杆菌中高效表达的原理： 转录： 启动子、 终止子、核糖体结合位点 翻译： 密码子、质粒拷贝数 启动子： Lac 表达系统 以大肠杆菌 lac 操纵子调控机理为基础设计、构建的表达系统 转录调控机理： 具有多顺反子结构，基因排列次序为：启动子（lacP）- 操纵基因（lacO）- 结构基因（lacZ-lacY-lacA）、正调节因子 CAP、 负调节因子 lac I 正调节因子 CAP ： cAMP激活CAP，CAP–cAMP复合物与 lac 操纵子上专一位点结合后，能促进 RNA 聚合酶与 –35、–10 序列的结合，进而促进 Plac 介导的转录。基因工程中使用的 lac 启动子均为抗葡萄糖代谢阻遏的突变型，即 Plac UV5 lac UV5 突变体： Plac UV5 突变体能够在没有 CAP 存在的情形下非常有效的起始 转录，受它控制的基因在转录水平上只受 lacI 的调控，因此用它 构建的表达载体在使用时比野生型 Plac 更易操作。 负调节因子 lac I ： 在无诱导物情形下， lacI 基因产物形成四聚体阻遏蛋白，与启动子下游的操纵基因紧密结合，阻止转录的起始。 Trp 表达系统： 以大肠杆菌 trp 操纵子调控机理为基础设计、构建的表达系统 转录调控机理： 色氨酸启动子 Ptrp 受色氨酸-阻遏蛋白复合物的阻遏，转录呈基底状态。在培养系统中去除色氨酸或者加入3-吲哚丙烯酸（IAA）， 便可有效地解除阻遏抑制作用。在正常的细菌培养体系中，除去色氨酸是困难的，因此基因工程中往往添加 IAA 诱导 Ptrp 介导的目的基因表达 Tac 表达系统： tac 启动子是由 trp 的 –35 序列和 lacUV5 的 –10 序列拼接而成的杂合启动子调控模式与 lacUV5 相似，但 mRNA 转录水平更高于 trp 和 lacUV5启动子（P tac = 3 P trp = 11 P lac），因此在要求有较高基因表达水平的情况下，选用 tac 启动子比用 lacUV5 启动子更优越。 lac、tac 启动子对宿主菌的要求：