CYP2C19SOP-操作流程CYP2C19SOP-操作流程.doc

海口海瑞康生物科技有限公司 操作规程/细则 编号：FD/PRO/0001 内容： CYP2C19基因检测 部门： 技术部 变更版本记录：2010年第一版 目的：为保证本实验室检测实验操作的标准化，确保检测结果的准确性、重复性，制定本规程。 标本要求： 1.样本的收集：静脉取血1ml，加至EDTA抗凝管中。 2.样本的贮存、运输：抗凝全血在室温保存不超过7天，2-8°C不超过1个月，-20°C不超过7周，血液样品反复冻融不超过5次。全血的运输必须遵守国家和当地有关规定。 操作步骤： 1基因组DNA提取 1.1处理血液材料 做CYP2C19基因型检测时，只需用200μl血液即可。当血液样品体积小于200μl时，可加适当体积PBS调整至200μl再进行下一步实验。 1.2 活化吸附柱 吸附柱在使用前需要活化，活化方法：将吸附柱置于收集管中，加入500 μl缓冲液BH1，静置2-3min，12,000 rpm（9,500×g）离心500 μl缓冲液BH2，12,000 rpm（9,500×g）离心20μl蛋白酶K溶液。 1.4 加入200μl血液样品（注意：在加入血液样本之前一定要把全血充分混匀）。 1.5 加入200μl缓冲液BL，振荡15秒，混匀。低速离心，使管壁血液离心至底部（注意：不可将缓冲液BL直接加入蛋白酶K中）。 1.6 56℃放置10分钟。 1.7 加200μl无水乙醇，振荡15秒，混匀，低速离心。 1.8 将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个已活化的吸附柱中（吸附柱放入收集管中），不要弄湿管口，12,000rpm（9,500×g）离心1min，弃去装废液的收集管，将吸附柱收集管中。 500μl缓冲液BW1（使用前请先检查是否已加入无水乙醇），不要弄湿管口，12,000rpm（9,500×g）离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放入收集管中。 1.10 向吸附柱中加入500μl缓冲液BW2（使用前请先检查是否已加入无水乙醇），不要弄湿管口，12,000rpm（9,500×g）离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放入收集管中。 1.11 将吸附柱放回收集管中，12,000 rpm（9,500×g）离心 1.12 将吸附柱转入一个干净的离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加60μl洗脱缓冲液BE，室温（推荐56℃）放置5min，12,000 rpm（9,500×g）离心PCR扩增 试剂的分装：CYP2C19扩增液（1和2）融溶后，将其分装到0.2ml离心管中，19μl/管。扩增产物短时间内可于2-8℃保存。 2. 1取出原先分装好的扩增液，在管内按照如下体系配制PCR反应液，并做好标记,每人份检测使用1管CYP2C19扩增液1(19μl/管)和1管CYP2C19扩增液2(19μl/管。 2.2取出原先分装好的扩增液，在管内按照如下体系配制PCR反应液，并做好标记。每人份检测使用1管CYP2C19扩增液1(19μl/管)和1管CYP2C19扩增液2(19μl/管) 扩增1： 试剂 体积（μl） 基因组DNA 5 CYP2C19扩增液1 19 反应液A 1 总体积 25 扩增2： 试剂 体积（μl） 基因组DNA 5 CYP2C19扩增液2 19 反应液A 1 总体积 25 2.3 将各0.2ml离心管放入PCR仪中，按下列条件扩增：50℃ 5min；94℃ 5min；94℃ 25sec，48℃ 40sec，72℃ 30sec，35 cycles；72℃ 5min 2.4 取出扩增产物，2～8℃保存。 3 杂交显色 3.1取出BaiO?杂交显色试剂盒。将反应液B低速离心，吸取10μl加入杂交缓冲液瓶中混匀，备用。 3.2临用前，取出1支抗体，低速离心，加入1ml抗体稀释剂，振荡混匀，制成抗体使用液，备用，剩余试剂-20℃保存。 3.3配制杂交反应液： 吸取180μl杂交缓冲液，加入10μl CYP2C19扩增产物1和10μl CYP2C19扩增产物2，混匀。 3.4按照下表要求，准备各管试剂于2ml离心管中。 试管盒位置 试剂名称 体积（μl） A 预杂交液 1200 B 杂交反应液 200 C 洗液1 800 D 洗液2 1600 E 抗体液 200 F 洗液3 400 G 显色液 200 3.5将准备好的离心管插入试管盒相应位置中。 3.6按照下表要求，设置百傲e-Hyb全自动杂交仪杂交程序。 步骤 反应时间(min) 反应