石榴果皮褐变实验方案16-2-23..doc

果皮褐变指数 果皮失重率和平均散失速率的测定 失重率采用称量法，每个样品50g,重复称量3次，取其平均值。 失重率（%）=（不同时间样品质量-样品初质量）/样品初质量× 100% 平均散失速率（%/d）=失重率/存放时间；其中%为散失百分率；d 为存放时间（d） 1.‘玉石籽’褐变过程中酶促褐变相关酶活性的变化 褐变过程中PPO，POD等活性变化。 PPO酶活性测定方法 石榴果皮PPO酶液的提取 取石榴果皮0.5g，置于研钵中，加入5mL 4℃下预冷的pH 7.0 的磷酸缓冲液（含1%聚乙烯吡咯烷酮和10 mmol/L 的抗坏血酸）和少量石英砂，冰浴研磨成匀浆，4℃ 下12000r.min-1 离心20min,上清液即为PPO和POD粗提液，4℃保存备用。 PPO活性测定参考张立华等（2007）的方法并改进，向反应管中加入2.95ml (邻苯二酚，浓度为0.2mol/L )，于25℃水浴中平衡3 min，取出试管，向其加中加50μL粗酶提取液（以煮过失活的酶液为对照），使用410nm波长处进行酶动力学分析，立即计时，扫描随后2min 内溶液在410 nm处的吸光度变化，每30s 读数一次，共记录5次，然后以每分钟内A410变化0.01为一个酶活性单位(U)。每个样品重复测定3次，取其平均值。 PPO 活性计算公式: （2）果皮过氧化物酶（POD）活性测定 采用愈创木酚比色法。 POD 活性测定参考印芳等( 2008) 的方法并改进：取上述粗酶液50μL 与2.95 mL POD 反应液( 0. 125 mL 愈创木酚+ 0. 255 mL 30% H2O2，用pH7. 0 磷酸缓冲液稀释至250 mL) ，使用紫外分光光度计在470 nm 波长下比色，每隔1 min 记录1 次吸光度，共记录5次，然后以每分钟内A470变化0. 01 为1 个酶活性单位( U) 。每个样品重复测定3 次，取其平均值。 酶活性= ( △A470 × VT ) /( W × VS × 0. 01 × t) 。(2) 式(2) 中，△A470为470 nm 条件下，反应时间内吸光值的变化； VT为酶液总体积(mL) ； W为试验材料鲜质量( g) ；VS为测定时所取的酶液体积( mL)； t为反应时间( min) ; 酶活性单位为U·min-1g -1 FW 酶活测定所需试剂配制方法： （1）pH 7.0 的磷酸缓冲液： 参照植物生理学实验指导用书配制。 （2）pH 7.0 的磷酸缓冲液（含1%聚乙烯吡咯烷酮和10 mmol/L 的抗坏血酸）： 1000 ml的pH 7.0磷酸缓冲液中加入10g聚乙烯吡咯烷酮和1.761g抗坏血酸溶解即可。 (3)0.2mol/L邻苯二酚溶液 称取11g 邻苯二酚用 500mL pH=7.0的磷酸缓冲液溶解。 (4)POD 反应液 0. 125 mL 愈创木酚+ 0. 255 mL 30% H2O2，用pH7. 0 磷酸缓冲液稀释至250 mL. 测定酶促反应底物含量变化 2.果皮总酚含量 取1g石榴果皮研磨成匀浆，加入20ml 60%的乙醇于50ml 三角烧瓶中，超声波 60℃提取40min，后过滤至25ml 容量瓶并定容（60%的乙醇）测定时取1ml 0.5mol/L 的福林酚试剂加入50微升提取液振荡混匀，再加入4ml 0.5mol/L 的Na2CO3溶液室温下反应60min，后于750nm 比色测定其吸光值A750。以没食子酸为标准制作标准曲线。 果皮总酚测定所需试剂配制方法： （1）60%的乙醇：取60ml纯乙醇用蒸馏水定容至100ml即可。 （2）0.5mol/L 的福林酚：购买福林酚（酚测定2mol/L）用蒸馏水稀释至0.5mol/L. (3)0.5mol/L Na2CO3：称取53g Na2CO3 加蒸馏水定容至1000ml。 （4）没食子酸为标准制作标准曲线: 精密称取没食子酸标准品0.010g，用蒸馏水溶解并定容至100mL，得浓度为0.1mg/mL，取此溶液5mL 定容到10mL, 浓度为0.05mg/mL。分别取0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2，1.4，1.6，1.8，2.0 mL 于10mL 容量瓶中，分别加入福林酚 试剂1mL，混匀，在0.5～8min内加入4mL 0.5 mol/L的Na2CO3溶液，充分混合后定容，室温下放置60min，以空白试剂为对照，750nm 下测定吸光值，每个样品平行测定三次。由吸光值对浓度回归，求得标准曲线。 3. DPPH自由基清除法测定抗氧化活性 取2方法制备的酚类物质提取液2.0ml ，再加入0.8mmol/L DPPH试剂2.0mL, 强烈振荡后静置30min ，以无水乙醇为空白，于