第18课时血红蛋白的提取和分离..doc

第18课时　血红蛋白的提取和分离 目标导航　1.了解色谱法、电泳法等分离生物大分子的基本原理。2.理解缓冲液的组成和作用机理。3.体验提取生物大分子的基本过程和方法。 一、分离蛋白质的基本方法原理 1．蛋白质的分离方法——凝胶色谱法 凝胶色谱法也称做________________，是根据________________的大小分离________的有效方法。 相对分子质量 直径大小 运动方式 运动速度 运动路程 洗脱次序 大 ____凝胶颗粒空隙直径，被排阻在____ 垂直向下移动 ____ 较短 先从凝胶柱洗脱出来 小 ____凝胶颗粒空隙直径，可以进入颗粒内部 垂直向下移动，无规则扩散进入凝胶颗粒 ____ 较长 后从凝胶柱洗脱出来 2.缓冲液的作用和组成 (1)作用 在一定范围内，缓冲溶液能够抵制外界________和________对溶液________的影响，维持pH基本不变。 纯水的pH因加入少量的强酸或强碱而发生很大变化。然而，1滴浓盐酸加入到1 L CH3COOH—CH3COONa混合溶液或NaH2PO4—Na2HPO4混合溶液中，[H＋]的增加不到百分之一(从1.00×10－7 mol/L增到1.01×10－7 mol/L)，pH没有明显变化。 (2)组成 缓冲溶液通常由________种缓冲剂溶解于水中配制而成，调节缓冲剂的____________就可以制得________________________的缓冲液，其类型主要有3种： ①弱酸及其对应盐，如CH3COOH—CH3COONa，H2CO3—NaHCO3。 ②多元弱酸的酸式盐及其对应的次级盐，如 NaHCO3—Na2CO3，NaH2PO4—Na2HPO4。 ③弱碱及其对应盐，如NH3·H2O—NH4Cl。 3．电泳 (1)概念 电泳是指____________在________的作用下发生________的过程。许多重要的生物大分子，如________、________等都具有可解离的基团，在一定的pH下，这些基团会带上________或________。在电场的作用下，这些带电分子会向着________________的电极移动。 (2)原理 在同一电场下，由于各种分子________性质的差异及分子本身________、________的不同，使带电分子产生________________，从而实现样品中各种分子的分离。 (3)常用方法 ①____________电泳：由于琼脂糖本身不带电荷，所以，各种分子在电场中的迁移速率因各种分子带电性质的差异、分子大小和形状不同而不同，从而得以分离。 ②________________电泳 加入SDS作用：使蛋白质发生完全变性，解聚成单条肽链；与各种蛋白质结合形成蛋白质—SDS复合物，SDS所带负电荷的量远远超过了蛋白质原有的电荷量，因而掩盖了不同蛋白质间的电荷差别，使电泳迁移率完全取决于分子的大小。 二、粗提取血红蛋白 1．红细胞的洗涤 (1)目的：____________，以利于后续步骤的分离纯化。 (2)过程 ：为防止血液凝固，需在采血器中加入抗凝血剂柠檬酸钠 ：500 r/min，离心2 min，这样做的目的是防止红细胞与白细胞一同沉淀，达不到分离效果 ：用胶头吸管吸去上层黄色血浆 ：向盛有暗红色红细胞液体的烧杯中加入五倍体积的生理盐水，缓缓搅拌10 min ：直至上清液中没有黄色，表明红细胞已经洗涤干净，否则需重复洗涤 (3)操作提示：洗涤次数、离心速度与离心时间十分重要，洗涤次数少，无法除去血浆蛋白，离心速度过高和时间过长会使白细胞等一同沉淀，达不到分离效果。 2．血红蛋白的____ (1)方法：将洗涤好的红细胞倒入烧杯中，加______到原血液的体积，再加40%体积的______，置于磁力搅拌器上充分搅拌10 min。 (2)目的：使红细胞吸水____，血红蛋白释放出来。 (3)原理：渗透作用。 3．分离血红蛋白溶液 (1)方法 ①将搅拌好的混合液转移到__________中，以2 000 r/min的速度____10 min。 ②将离心管中的液体部分用滤纸过滤，除去脂溶性沉淀层。 ③将滤液置于分液漏斗中，静止片刻后，分出下层的红色透明液体，即为血红蛋白溶液。 (2)目的：使________与大部分杂质分离开，便于后续纯化。 (3)离心后试管中的溶液分为4层，最上面的一层是甲苯层，第二层是脂溶性物质沉淀层，第三层是血红蛋白水溶液层，最下层是杂质沉淀层。 4．粗分离——透析 (1)原理：______能使小分子自由进出，而将大分子保留在袋内。 (2)过程：取1 mL的血红蛋白溶液装入透析袋中，将透析袋放入盛有300 mL的物质的量浓度为20 mmol/L