细胞免疫荧光..doc

DAPI DAPI即4,6-二脒基-2-苯基吲哚(4,6-diamidino-2-phenylindole)，是一种能够与DNA强力结合的荧光染料，常用于荧光显微镜观测。因为DAPI可以透过完整的细胞膜，它可以用于活细胞和固定细胞的染色。 在荧光显微镜观察下，DAPI染剂是利用紫外光波长的光线激发。当DAPI与双股DNA结合时，最大吸收波长为358nm，最大发射波长为461nm，其发散光的波长范围含盖了蓝色至青绿色。DAPI也可以和RNA结合，但产生的荧光强度不及与DNA结合的结果，其发散光的波长范围约在400nm左右。 DAPI的发散光为蓝色，且DAPI和绿色荧光蛋白(Green fluorescent protein, GFP)或Texas Red染剂(红色荧光染剂)的发散波长，仅有少部分重叠，研究员可以善用这项特性在单一的样品上进行多重荧光染色。 DAPI能快速进入活细胞中与DNA结合，因此DAPI对生物体而言，也被视为一种毒性物质与致癌物。使用过程中应注意操作与抛弃的处理程序。 染色原理： DAPI 为一种荧光染料，可以穿透细胞膜与细胞核中的双链DNA结合而发挥标记的作用，可以产生比DAPI自身强20多倍的荧光，和EB相比，对双链DNA的染色灵敏度要高很多倍。显微镜下可以看到显蓝色荧光的细胞，荧光显微镜观察细胞标记的效率高(几乎为100 %) 。DAPI染色常用于细胞凋亡检测，染色后用荧光显微镜观察或流式细胞仪检测。DAPI也常用于普通的细胞核染色以及某些特定情况下的双链DNA染色。细胞经热激处理后用DAPI染色3分钟，在荧光显微镜下可以看到到细胞核的形态变化。 a、 正常的烟草细胞核：核形完整，染色质均匀。 b、染色质固缩，向外周聚集，形成周边化。 c、 染色质进一步固缩，形成很多颗粒物质。 d、 细胞核破裂形成碎片，核解体。 染色步骤编辑 在细胞移植前，将DAPI 以一定的浓度加入培养基中，与细胞共同孵育过夜，用PBS 缓冲液漂洗至少6 次以洗掉未结合的DAPI，再用酶消化后离心收集细胞，加入DMEM 培养基制成细胞悬液以备用。 存储条件：-20℃避光保存 每次使用，用量较少，可反复冻融，无需分装 注意事项： 1、DAPI强烈致癌，操作时要戴上手套。 2、贮存液用70%酒精配制，浓度100 μg/ml，可用黑纸包住，长期冻存。使用液按1:1000用PBS稀释，最终浓度100 ng/ml。 3、DAPI是非常优秀的DNA染料，固定过和没有固定过的活细胞均可用DAPI染色。 376.32 别 名：5-FAM 结构式： 5-Carboxyfluorescein 性状：溶于水,溶于DMSO和DMF：?20°C干燥避光保存5-FAM主要应用于DNA自动测序中，标记其中的d/ddCTP三磷酸胞嘧啶脱氧核苷酸 2,3-双脱氧胞嘧啶三磷酸，也经常用于PCR产物定量，核酸探针等。FAM梭基荧光素(carbox州uorescein)是荧光素 衍生物的一种,其中5一FAM(carbox姆uorescein一 sueeimidvlester),广泛存在于荧光标记试剂盒(Ap- plied Bio叮stems Co甲oration,AmpF比声脯ler Rus翎,PeRA呷li6eation Kit User乞Manual;Prome罗 Co甲oratoin,Gene而ntTM PowerPlexTM,1.2 System Technic以Manual)。FAM与氨基反应快速,产物也更 稳定,适用于氢离子激光(Argon一ionl丑ser)的 488nm光谱线,Abs/Em=492/slsnm(pH=9.0), 具有荧光素衍生物的普遍特性,在水中稳定。异硫氰酸荧光(fluorescein isothiocyanate, FITC) FITC纯品为黄色或橙黄色结晶粉末，易溶于水和酒精溶剂。有两种异构体，其中异构体型在效率、稳定性与蛋白质结合力等方面都更优良。FITC分子量为389.4，最大吸收光波长为490～495nm，最大发射光波长为520～530nm，呈现明亮的黄绿色荧光。FITC在冷暗干燥处可保存多年，是目前应用最广泛的荧光素。其主要优点是人眼对黄绿色较为敏感，通常切片标本中的绿色荧光少于红色。 蛋白荧光标记试剂，也是医学诊断药物，主要用作荧光抗体技术中的荧光染料，能和各种抗体蛋白结合，结合后的抗体不丧失与一定抗原结合的特异性，并在碱性溶液中具有强烈的绿色荧光。用于医学，农学和畜牧等方面，可对由地细菌病毒和寄生虫等所致疾病进行快速诊断。5-FITC [FITC Isomer I; fluorescein-5-isothiocyanate] 异硫氰酸荧光素3326-3