分子荧光测定海水中氨氮含量.doc

实验 荧光分析法测定海水中氨氮的含量 一、 实验原理[1] 1.1 方法原理 海水中的氨氮与邻苯二甲醛（o-Phthaldehyde, OPA）、亚硫酸钠在碱性介质中反应，生成具有荧光性的异吲哚衍生物，当其吸收了外界能量后，能发射出一定波长和强度的光称为荧光。外界提供能量的方式有多种，通过光照射激发产生的荧光称为光致荧光。 由于不同的物质其组成与结构不同，所吸收光的波长（λex）和发射光的波长（λem）也不同，利用这两个特性参数可以进行物质的定性鉴别。在λex和λem一定的条件下，如果物质的浓度不同，它所发射的荧光强度（IF）就不同，两者之间的定量关系可用下式表示： IF=KC 式中：IF——能发荧光物质的荧光强度； C——能发荧光物质的浓度； K ——一定条件下的常数。 当激发光强度、波长、所用溶剂及温度等条件固定时，物质在一定浓度范围内 ，其发射荧光强度与溶液中该物质的浓度成正比，测量物质的荧光强度可对其进行定量分析。荧光分析法就是利用物质的荧光特征和强度，对物质进行定性和定量分析的方法。 1.2 仪器原理 利用荧光进行物质定性定量分析的仪器有荧光计和荧光分光光度计，本次实验所用的是荧光分光光度计，其基本原理[2]是：采用氙灯作光源，通过狭缝经光栅分光后照射到被测物质上，发射的荧光用光电倍增管检测，经放大后由数据采集系统记录结果。该仪器由四个基本部分组成[2]，即激光光源、样品池、用于选择激发波长和荧光波长的单色器或滤光片、检测器。图1为荧光分光光度计的结构示意图。 图1 荧光分光光度计结示意图 激发光源：选择激发光源主要应考虑它的稳定性和强度，光源稳定性直接影响测定的精密度和重复性，而强度则直接影响测定的灵敏度和检出限，目前大部分荧光分光光度计采用高压氙灯作为光源。 样品池：通常采用低荧光的石英材质制成的方形或长方形池体。 单色器：荧光分析仪具有两个单色器，分光光度计采用光栅，荧光计采用滤光片。第一个单色器置于光源和试样池之间，用于选择所需的激发波长，是之照射与被测试样上。第二个单色器置于样品池与检测器之间，用于分离所需检测的荧光发射波长。 检测器：荧光强度通常较弱，需要较高灵敏度的检测器，一般采用光电倍增管，检测位置与激发光成直角。 二、 仪器与试剂 2.1 仪器 100-1000 μL(Finnpipette)移液枪，25?mL比色管，石英比色池（1 cm），洗瓶2个 ，F96pro荧光分光光度计（上海棱光技术有限公司制造) 2.2 试剂 氨氮标准使用液（100 μmol/L），亚硫酸钠溶液（10 mmol/L），四硼酸钠溶液（10 g/L）,OPA溶液（25 mmol/L），未知溶液B 三、 实验步骤 3.1 标准工作曲线溶液的配制及测定 3.1.1 取0.00、0.50、1.00、1.50、2.00 mL氨氮标准使用液标样于比色管中，用超纯水定容至25.00 mL。 3.1.2 分别加入四硼酸钠溶液、亚硫酸钠溶液和OPA溶液，各1.00 mL，混匀后静置30 min。 3.1.3 扫描发射波长，确定最佳发射波长。 3.1.4 在选定的激发波长和发射波长下测定标准样品的荧光值, 绘制标准工作曲线。 3.2 待测样品浓度的测定 3.2.1取25.00 mL的待测样品，衍生处理与上述步骤相同（样品做三个平行样）。 3.2.2根据标准工作曲线计算待测海水样品中氨氮的含量。 四、数据处理与结果 4.1 最佳发射波长的确定 在选定的激发波长下，用分子荧光分光光度计对一定浓度的标准样品所发射出的波长在300-500 nm内的荧光强度进行扫描，得到该溶液荧光强度和发射波长的数据，利用origin 8.5软件对数据进行处理，绘制得到如下光谱曲线，如图1所示， 由图可知，在一定激发波长下，氨氮溶液发出的423 nm的荧光强度值最高，选取此发射波长进行测定时灵敏度高误差最小。 图1荧光发射光谱图 4.2 绘制标准工作曲线 用F96pro荧光分光光度计测定所配标准溶液氨氮荧光强度，取三次测定结果的平均值，得数据如表1所示。 表1标准工作曲线的测定数据 序号 标准溶液中氨氮的浓度（μmol/L） 荧光强度（IF） 1 0.00 66.40 2 2.00 102.21 3 4.00 191.68 4 6.00 209.36 5 8.00 333.48 对测量结果进行简单分析计算可知，第四个数据与其他数据的相关性较差对做出的标准曲线图会产生影响从而影响测量结果，作图之前需要先舍弃。该数据产生的原因可能有二:1.由于仪器工作不稳定，在测量第四组数据时仪器的光源发射出的光的