乙型腦炎病毒研究.docxVIP

中文摘要 目的：流行性乙型脑炎是危害人类健康比较严重的虫媒病毒。尽管目前乙脑的发病率有所下降，但发病区域仍呈现不断扩大的趋势。加强乙脑的监测，就可以评估该地区乙脑的流行状况。蚊子是JEV的主要传播媒介，对蚊子的流行性乙型脑炎病毒和虫媒病毒进行分子流行病学监测，对疾病预防具有防范意义。 方法：首先将云南省景洪县采集15份蚊虫样品研磨接种BHK-21和C6/36单层细胞，待出现细胞病变。提取病毒RNA，并反转录cDNA进行PCR鉴定将目的基克隆到pMD18-T载体，送上海生工测序。同时进行盖塔病毒、辛德毕斯、基孔肯雅病毒的PCR鉴定，回收并测序。在此基础上构建了乙脑基因I型标准质粒，建立了基于SYBR Green I染料的Real-time PCR检测方法，选取Ct值制作标准曲线。 结果：乙脑PCR扩增目的基因经测序验证为乙脑基因I型，然后构建应用荧光定量PCR标准质粒。研究建立的标准曲线能够准确定量目的基因，线性相关度很高，呈现良好的重复性，熔解曲线为单一峰型，未出现非特异性扩增。SYBR Green I Real-time PCR与传统方法相比灵敏度要高10倍，而且与猪蓝耳病毒等，均不发生非特异性扩增，具有良好的特异性。 结论：鉴定了基因I型乙脑病毒，并构建了快速检测乙脑I型的检测方法。通过实验初步验证了其具备良好的灵敏性和重复性，为以后乙脑的流行病学调查奠定了基础。 关键词：乙型脑炎病毒 基因I型 虫媒病毒 荧光定量PCR 前 言 乙型脑炎病毒，主要引起病毒性脑炎，每年可导致10,000–15,000人死亡，然而乙型脑炎是一个被忽视的热带病。本病容易引发中枢神经系统疾病，临床上以高热、意识障碍、呼吸衰竭等神经症状为特征，具有明显的季节性和地域性。本病的致死率为25-30%，相当一部分为婴儿，50%可造成永久性后遗症。乙型脑炎病毒分布区域已经广泛而且还在不断地向亚洲和大洋洲区域扩展，因此乙型脑炎病毒被认为是新发和再度出现的病原菌。尽管有许多有效的免疫措施，乙型脑炎依然是一个影响全球健康的疾病。乙型脑炎病毒可能是通过野生或者驯养的环境传播前者，主要是野鸟作为扩散宿主，后者主要是猪作为扩散宿主。库蚊，特别是三带喙库蚊，是最主要的媒介。乙脑目前有5个基因型流行，研究发现基因型I已经取代基因型III为主导乙脑病毒基因型。 在据报道在1949年中国大陆的报道了第一个JE病例，之后中国有成为亚洲的高度流行区。20世纪50年代以来，100余株乙脑病毒从不同的宿主分离到。因此JE是在中国法律上报告传染病。虽然近年来乙脑的发病率和死亡率均下降，但对于在中国流行的乙脑病毒各地方株之间的差异所知甚少。 虫媒病毒由蚊子和蜱传播的疾病。虫媒病毒主要分布于温带、热带和亚热带，世界上大多数地区都有虫媒病毒的分离。虫媒病毒引起诸多症状如全身性发热、关节炎、出血和脑炎等, 甚至导致神经麻痹及损伤，严重的还可以引起死亡。虫媒疾病的发病率一般随季节性变化，受温度或降雨的波动影响及脊椎动物宿主丰富程度。疫情发生则是当环境条件有利于虫媒病毒传播周期内显著扩增。近年来随着中国与东盟等国家的贸易、旅游等活动的进一步发展，中国存在着虫媒病毒暴发的风险本研究选取在云南省报道过的虫媒病毒，盖塔病毒、基孔肯雅和辛德毕斯，进行分子生物学调查和病毒分离。 文献综述 1 乙型脑炎病毒的研究进展 流行性乙型脑炎（乙脑）又称日本乙型脑炎病毒（Japanese encephalitis virus，JEV）是由蚊子传播的病毒性脑炎疾病，严重危害人类的健康。过去的几十年，动物传染性疾病（由野生或饲养动物传染给人）的发病率显著增加了70%或更多[1]。乙型脑炎病毒作为为亲神经的黄病毒科黄病毒属成员，可通过蚊子将病毒从动物传播给人。在人类中，这种人畜共患疾病在世界范围内引起流行性病毒性脑炎，影响中枢神经系统（CNS) [2-3]。有关乙型脑炎的发病机理和本病的临床表现（包括严重的神经症状）的一些因素已被深入研究[4-5]。本病潜伏期为5-15天，乙型脑炎的致死率为25-30%，相当一部分为婴儿，50%可造成永久性后遗症。1871年在日本，乙型脑炎第一次发现 [6]。尽管1941年研究出了有效疫苗，而且随着的国家性的免疫措施大大降低了乙型脑炎的发病率，但仍有一些零星感染事件发生，而且在南亚，东亚，东南亚以及大洋洲地区仍旧广泛地传播[7]。目前，超过30亿人生活在乙型脑炎流行的国家。虽然所有年龄段的人都可能感染乙型脑炎病毒，但儿童乙型脑炎的发病率更高，这主要是因为大部分成年人具有免疫力[8]。目前，每年大约有68000例乙型脑炎，至少导致10000-15000人死亡[9-10]。 1.1乙脑基因结构 日本脑炎病毒是黄病毒科家族成员，是单股正链RNA病毒[11]，外面有衣壳包被,