乙型脑炎减毒活疫苗乙型脑炎减毒活疫苗.doc

乙型脑炎减毒活疫苗 Yixing Naoyan Jiandu Huo Yimiao Japanese Encephalitis Vaccine, Live 本品系用乙型脑炎（简称乙脑）减毒株病毒接种于原代地鼠肾细胞，经培养、收获病毒液、加入适宜稳定剂后冻干制成，用于预防乙型脑炎。 1 基本要求 生产和检定用设施、原材料及辅料、水、器具、动物等应符合“凡例”有关要求。 2 制造 2.1 生产用细胞 生产用细胞为原代地鼠肾细胞或连续传代不超过5代的地鼠肾细胞。 2．1．1 细胞管理及检定 应符合“生物制品生产和检定用动物细胞基质制备及检定规程”规定。 2.1.2 细胞制备 选用10～14日龄清洁地鼠，无菌取肾，剪碎，经胰蛋白酶消化，用培养液分散细胞，制备细胞悬液，分装培养瓶，置37±1℃培养。细胞生长成致密单层后接种病毒。来源于同一批地鼠同一容器消化制备的地鼠肾细胞为一个细胞消化批同一批地鼠同一天制备的细胞为一个细胞批2.2 毒种 2.2.1 名称及来源 生产用毒种为乙脑病毒SA14-14-2减毒株。 2.2.2 种子批的建立 应符合“生物制品生产和检定用菌毒种管理规程”规定。 原始种子批传代应不超过第6代，主种子批应不超过第8代，工作种子批应不超过第9代,生产的疫苗应不超过第10代。 2.2.3 种子批的检定 主种子批应进行以下全面检定， 工作种子批至少应进行2.2.3.1~2.2.3.4项检定。 2.2.3.1 鉴别试验 取毒种做10倍系列稀释，取适宜稀释度分别与非同源性乙脑特异性抗体和乙脑阴性血清混合，置37℃作用90分钟，分别接种地鼠肾单层细胞或BHK21细胞进行中和试验，观察5～7天判定结果。中和指数应大于1000。 2.2.3.2 病毒滴定 取毒种作10倍系列稀释，至少取3个稀释度的病毒液，分别接种BHK21细胞，用蚀斑法进行滴定。冻干种子批病毒滴度应不低于应5.7 LgPFU/ml；液体种子批病毒滴度应不低于 7.2 LgPFU/ml。 2.2.3.3 无菌检查 依法检查（附录XII A ），应符合规定。 2.2.3.4 支原体检查 依法检查（附录XII B ），应符合规定。 2.2.3.5 病毒外源因子检查 依法检查（附录XII C），应符合规定。 2.2.3.6 E蛋白基因稳定性试验 以E蛋白基因区核苷酸序列测定验证其遗传稳定性。编码E蛋白基因区的8个关键位点氨基酸不能发生改变（E-107：苯丙氨酸,E-138：赖氨酸，E－176：缬氨酸，E－177：丙氨酸，E－264：组氨酸，E－279：蛋氨酸，E－315：缬氨酸，E－439：精氨酸）。 与基因库中登录号为D90195的乙型脑炎减毒株SA14－14－2株的E蛋白基因区核苷酸序列的同源性不低于99.6%。 2.2.3.7 免疫原性检查 用主种子批制备疫苗，取10-3、10-4、10-5至少3个稀释度， 分别免疫体重为10～12g小鼠10只，每只皮下注射0.1ml，免疫1次。免疫后14天用P3株乙脑强毒腹腔攻击，每只注射0.3 ml，其病毒量应不低于500腹腔滴定的LD50 。同时每只小鼠脑内接种稀释液0.03ml。攻击后14天判定结果。ED50应不高于3.0 LgPFU，攻击对照组小鼠死亡率应不低于80%。 2.2.3.8 猴体神经毒力试验 用冻干主种子批进行猴体神经毒力试验。将主种子批毒种（病毒滴度不低于5.7 LgPFU/ml），分别注射10只恒河猴的两侧丘脑各0.5ml和腰部脊髓内0.2ml。对照组用强毒SA14株稀释成102PFU/ml和103 PFU/ml病毒量, 以同法接种猴子，每个稀释度注射4只猴子，注射部位同试验组。 对SA14-14-2减毒株组的10只猴子观察至少21天，应无任何特异性乙脑发病症状，组织学检查仅表现为注射部位、脑和脊髓有轻微的炎症反应。而对照组SA14株在注射后8天内病毒量103 PFU/ml组4只猴子应全部死亡； 病毒量为102 PFU/ml组的4只猴子，至少应有2只猴子死亡。组织学检查表现主要特征为神经细胞坏死，较少炎症反应。 2.2.3.9 脑内致病力试验 用种子批毒种接种体重为12～14g小鼠，至少10只，每只脑内注射0.03ml，观察14天应活存。接种后3天内死亡者不计，但3天内死亡数不得超过20%。3天后如有小鼠发病，应处死后取脑，测定致病力。小鼠脑内毒力应不高于3.0 LgLD50/0.03ml，同时以10-1病鼠脑悬液皮下注射体重为10～12g小鼠10只，每只0.1ml，观察14天，应全部健存。 2.2.3.10 皮下感染入脑试验 用种子批毒种接种体重为10～12g小鼠10只，每只皮下注射0.1ml，同时右侧脑内空刺，观察14天，应全部健存。 2.2.3.11 乳鼠传代返祖试验 用病毒滴度