新型抑菌蛋白APn5抑制胡萝卜软腐欧文氏菌.docVIP

ISSN 0001-6209; CN11-1995/Q 新型抑菌蛋白APn5抑制胡萝卜软腐欧文氏菌 韩冬梅班慧芳喻子牛孙明*(华中农业大学生命科学技术学院农业微生物学国家重点实验室，武汉 430070)摘要：基质协助激光解吸附离子化-飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)和电喷雾四极杆飞行时间串联质谱(Q-TOF)分析对蛋白酶E敏感，对蛋白酶K和胰蛋白酶部分敏感酸性环境下其抑菌活性稳定，碱性环境下活性。在BSn5的发酵上清液对数生长期抑菌活性逐渐升高，进入稳定期后抑菌活性开始下降，直至完全消失。枯草芽胞杆菌；抑菌蛋白；抑菌；性质鉴定枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)是一种在自然界中广泛存在的非致病菌，也是常见的植物内生菌，可以定殖在植物的各个器官[1]。枯草芽胞杆菌具有发达的分泌系统和较强的环境适应性、抗逆性，能够产生多种具有抗菌生物活性的代谢产物，对多种病原菌具有拮抗性能，在农业生产、医药领域具有广泛的应用[2]。枯草芽胞杆菌产生的抗菌物质主要分为两大类，一类是低分子量抗菌肽蛋白类抑菌物质，包括环状肽或环状脂肽，也有些为线状肽，表面活性素(Surfacin)、伊枯草菌素(Iturins)和Fengycins等，分子量约1000 Da (介于300 Da-3000 Da)这一大类占枯草芽胞杆菌抑菌物质的绝大部分；另一类主要包括聚酮类、氨基糖类以及脂肽类等抗生素[]。目前，对枯草芽胞杆菌所产生的低分子量抗菌肽类物质的作用机制、自身免疫机制、合成途径以及基因克隆等方面已有较为深入的研究，但对分子量较大的蛋白类抑菌物质的报道较少，国内外对该类抑菌物质的研究多集中在活性鉴定、理化性质研究等方面。sclerotinia sclerotiorum)菌核伴生的枯草芽胞杆菌中分离出来一种大小为20 kDa的蛋白，对真菌具有抑菌活性[9]；Liu等从枯草芽胞杆菌B-916中分离出来的对真菌具有较强抑菌活性的蛋白Bacisubin，大小为41.9 kDa，具有一定耐热性，对蛋白酶敏感，具有较宽的pH适应范围，MALDI-TOF-MS和Q-TOF测序发现该蛋白与草酸盐脱羧酶具有显著相关性[10]；谌晓曦枯草芽胞杆菌BSn5分离自在组织培养过程中被细菌感染的花魔芋愈伤组织，经检测对能够引起魔芋软腐病的胡萝卜软腐欧文氏菌SCG1具有抑菌作用，并从中分离纯化出一种大小约为31.6 kDa的抑菌蛋白，命名为APn5[]。在以上研究的基础上，本研究对枯草芽胞杆菌BSn5和蛋白APn5进行了更深入的鉴定和研究。1 材料和方法 1.1 材料 1.1.1 菌株枯草芽胞杆菌菌株BSn5，本研究室分离自魔芋(Amorphophallus konjac)愈伤组织。病原菌胡萝卜软腐欧文氏菌胡萝卜软腐亚种(Erwinia carotovora subsp. carotovora)SCG1、茄科雷尔氏菌(Ralstonia solanacearum)、水稻细条病菌(Xanthomonas campestris pv oryzicola)、草生欧文氏菌(Erwinia herbicola)、杓兰欧文氏菌(Erwinia crypripedii)、青枯劳尔氏菌(Ralstonia solanacearum)以及带化红球菌(Rhodococcus fascians)由本研究室保存。番茄叶霉病菌(Fulvia fulva)、西瓜枯萎病菌(Fusarium oxysporum f. sp. niveum)以及玉米小斑病菌(Bipolaris maydis)由华中农业大学李国庆教授提供。 1.1.2 主要试剂和仪器蛋白胨、酵母粉、NaCl、(NH4)2SO4、琼脂粉、PDA培养基、聚丙烯酰胺、十二烷基磺酸钠等生化试剂均购自武汉天源生物技术有限公司。超滤管购自millipore公司。离心机型号为5415D，购自Eppendorf公司；恒温摇床型号为HQL150C，购自中国科学院武汉科学仪器厂；生化培养箱型号为LRH-250A，购自广东省医疗器械厂。 1.2 培养基与培养条件细菌培养使用LB(Luria-Bertani)培养基[]。真菌培养使用PDA(Potato Dextrose Agar)培养基(BD Difco)。各种细菌、真菌培养条件均为28。 1.抑菌蛋白APn5的提取纯化 接种枯草芽胞杆菌BSn5于LB培养液中，28培养20 h，以1000×g离心10 min，弃沉淀收集培养液上清。按照164 g/L的浓度缓慢加入(NH4)2SO4，并不断振荡最终使(NH4)2SO4饱和度达到30%。静置2 h以上，以1000×g于4离心20 min，弃上清，用适量的去离子水溶解沉淀，移至透析袋(截留分子量为8 ~10 kDa)，于去离子水中4透析48 h，用聚乙二