免疫组化2-基本原理免疫组化2-基本原理.ppt

免疫组织化学技术 * * 抗原＋抗体（特异性）＋标记物，原位显示组织或细胞内抗原的一门技术。 根据抗体标记物不同： 酶---免疫酶组织化学 荧光素---免疫荧光组化 胶体金---免疫胶体金组化 高亲和力物质---亲和免疫组化 其中，免疫酶组织化学应用广泛 以其为例，掌握免疫组化基本原理 免疫酶组化特点： 信号定位准确 标本可长期保存 阳性标记与病变关系 方法简便，易推广 酶选择标准： ★ 该酶用细胞化学易于被检出，能被光镜或电镜观察。 ★ 酶反应产物须稳定，不扩散，具有良好定位。 ?★ 酶易于纯化，获得纯制品。 ★ 酶与免疫球蛋白结合后，不丧失其活性。 ★酶在PH中性液内较稳定。 ★组织中不应存在与底物作用的内源性酶。 符合上述条件： 辣根过氧化物酶---HRP 硷性磷酸酶---AKP 葡萄糖氧化酶---GOD （一）辣根过氧化物酶（HRP） ★ 分子量（40000），不会遮盖抗原的结合部位 ★ 稳定，易获得较高纯度酶 ★ 具有较高活性及特异性 ★ 可溶性佳，生成的产物不扩散 ★ 组织中内源性酶较少 ★ 可作用于多种底物，产生不同颜色 ★ HRP穿透力强，易进入细胞内 HRP的底物：低浓度的H2O2，供氢体为胺类及酚类化合物。 HRP显色反应： HRP＋H2O2 HRP＋H2O＋电子供体（氧化型） 电子供体 电子供体被氧化后，迅速改变颜色，通过聚合等反应，生成不溶性有色颗粒，并就地原位沉淀。 HRP常用的电子供体： ● 3.3-二氨基联苯胺(DAB)～棕色 ●氨乙基卡巴唑(AEC)～红色，易溶于有机溶剂，易扩散，用水溶性封固剂。 ●4-氯-1-茶酚（4CN）～蓝色，易弥散，不能久保存 ●3.3，5.5-四甲基联苯胺(TMB) ～黄色 （二）硷性磷酸酶（AKP） 从小牛肠粘膜或大肠杆菌中提取 ● 组织穿透能力较弱 ● 内源性AKP较高 ● 左旋咪唑具有抑制作用 AKP底物： AKP常用的底物为α-萘酚AS-B1磷酸盐 偶联试剂：固兰BB～蓝色 固红TR～红色 （三）葡萄糖氧化酶（GOD） 底物为葡萄糖，终产物稳定 ● 体内无内源性GOD ● 分子量大，穿透力较弱 第一节 基 本 原 理 酶标记抗体法（Enzayme Labelled antibody）是将酶通过共价键结合在抗体分子上，制备成酶标记抗体，通过抗体去寻找相应抗原。 一、酶标记抗体法 组织抗原 第一抗体 过氧化物酶 直接法 （一）直接法 原理：HRP标记在特异性抗体（第一抗体）上，抗原---抗体● HRP复合物 步骤：一步完成 优点：简便、省时 特异性强，非特异染色轻 缺点：敏感性差 一种标记抗体只能检测一种抗原 组织抗原 第一抗原 第二抗体 过氧化物酶 间接法 （二）间接法 原理：HRP标记在第二抗体上， 抗原---特异性抗体---第 二抗体● HRP复合物 优点：较直接法敏感性高 一种标记抗体能用于相应动物制备的多种特异性抗体，检测多种抗原 缺点： 较直接法费时 非特异性染色稍重 步骤：二步法 ● 制备抗酶抗体 ● 制备PAP复合物 酶桥法 组织抗原 第一抗体 第二抗体 第三抗体（抗酶抗体） HRP 二、酶桥法 原理：HRP标记在抗酶抗体（三抗）上， 抗原---特异性抗体---第 二抗体---第三抗体● HRP复合物 一抗、三抗有何关系？ 优点：与酶标记抗体法相比，敏感性高 （酶与三抗通过抗原-抗体反应 结合，避免直接标记引起两者活性降低） 缺点： 较费时 步骤：四步法 一、PAP法 原理：抗原---特异性抗体---第 二抗体（桥抗体）--- PAP复合物 组织抗原 第一抗原 第二抗体 PAP复合物 HRP 三、PAP法（过氧化物酶抗过氧化