(食品发酵实验讲义.docVIP

实验一　α－淀粉酶的制备 一、实验目的 学习并掌握α－淀粉酶的制备工艺。 二、实验原理 α－淀粉酶广泛存在于植物、哺乳动物和微生物中。α－淀粉酶是内切酶，酶的作用点仅限于淀粉链的α－1，4糖苷键，对α－1，6糖苷键不能作用，但能越过α－1，6糖苷键，将α－1，4糖苷键随机切断成长短不一的短链糊精，而使淀粉对碘呈蓝紫色的特异性反应逐渐变红棕色。在酶解的最初阶段，α－淀粉酶对淀粉的水解速度很快，但当水解到一定程度后，水解虽在继续进行，水解速度却变得缓慢。该酶的最小作用底物是麦芽三糖以上的低聚糖，对麦芽三糖的作用很弱，对麦芽糖没有水解能力。 枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis））glucoamylase, EC 3.2.1.3)，其作用方式不像α-淀粉酶那样无作用次序,而是从底物链的非还原性末端开始,顺次切下一个个葡萄糖单位,遇到分支处的α-1,6糖苷键时,可将α-1,6糖苷键切开,然后继续作用α-1,4糖苷键,直到产物全部成为葡萄糖为止。但糖化酶对α-1,6糖苷键的作用速度远不及对α-1,4糖苷键的作用速度，因此水解支链淀粉多的淀粉时，需延长水解作用时间或添加部分支链淀粉酶。 我国糖化酶的生产主要由黑曲霉优良菌种经深层发酵精制提炼而成。（Aspergilus niger）?菌株活化及平板扩大培养?摇瓶培养 1.菌株活化及扩大培养 ①制备PDA培养基：去皮马铃薯200 g切成小块，加水约500 mL，煮沸30 min，然后用纱布过滤，滤液加蔗糖20 g，琼脂20 g。溶化后加水定容至1000 mL，分装于250 ml锥形瓶中，121℃灭菌20 min，自然pH。 ②接种：取灭菌后PDA培养基倒平板，冷却后，接种斜面保藏的黑曲霉（Aspergilus niger） 2.摇瓶发酵培养 ①发酵培养基的制备： 玉米粉培养基：玉米粉30g,米糠5g,麸皮5g,加水1000ml,拌匀至无干粉又无结团，分装于250 ml锥形瓶内，每瓶100 ml, 自然pH，121℃灭菌20 min。 ②接种与产酶培养:取培养72h的黑曲霉平板，用打孔器打孔制成菌片。每个锥形瓶中接种12片，28℃振荡培养96 h。 3.离心 将摇床培养4d的黑曲霉发酵液4层纱布过滤后离心（10000r/min，10min）除菌体，所得上清液即为糖化酶粗酶液。 实验三 糖化酶活力测定 一、实验目的 1. 掌握糖化酶酶活定义及其计算方法。 酶活定义：将1g固体酶粉（或1ml液体酶），于40℃、pH4.6的条件下，1 h分解可溶性淀粉产生1mg葡萄糖所需的酶量定义为1个酶活力单位，以u/g（u/mL）表示。 2. 掌握糖化酶的测定方法及原理。 二、实验原理 糖化酶是一种外切型糖苷酶，可从淀粉分子的非还原性末端依次水解α-1，4-糖苷键生成葡萄糖。本实验3，5．二硝基水杨酸(DNS)与葡萄糖共热后被还原成棕红色的3－氨基－5硝基水杨酸在波长540nm处有较强光吸收且吸光度值与葡萄糖量呈正比的原理，利用分光光度计测定显色反应的吸光度值并根据吸光度值与葡萄糖含量的相互关系（见附图）确定糖化酶活力。 附图：葡萄糖标准曲线 三、实验材料 1.仪器：恒温水浴锅、分光光度计、秒表、比色管、玻璃仪器等 2.酶液：实验二所得粗酶液 3.试剂 （1）0.2 mol/L pH 4.5醋酸缓冲液：称取无水醋酸钠，溶解定容至1000。取分析纯冰醋酸定容至000 mL（B液）。混合1mo1/L NaOH溶液:称取4g NaOH加蒸馏水溶解，定容至1000 ml。 （3）1% 3，5-二硝基水杨酸（DNS）试剂：酒石酸钾钠100 g溶于400 mL蒸馏水，加热中依次加入NaOH 5 g，3，5-二硝基水杨酸5 g，苯酚1 g，亚硫酸钠0.25 g，搅拌至溶。冷却后定容至500 mL，储于棕色瓶室温保存。 （4）2％可溶性淀粉溶液：准确称取2可溶性淀粉(预先于100105℃烘干约2)，加少量蒸馏水调匀倾入80左右的沸蒸馏水中，继续煮沸至透明，冷却后定容至100。 　于甲、乙两支50 mL比色管中，分别加入2％可溶性淀粉25 mL及0.2mol/L醋酸2 mL蒸馏水作对照，摇匀，立即记时，准确反应30 min。取出试管，各加1 mo1/L NaOH溶液0.2 mL终止酶反应，冷却至室温。吸取上述反应液与空白液各2.5 mL于25 mL比色管中，用蒸馏水定容至刻度。分别吸取稀释液2 mL于试管中，加入2 mL DNS，共同沸水浴3min，冷却至室温后测定540nm处的光吸收值。比色时空白液用于调零。 五、实验结果 根据下式计算出发酵液的酶活大小 X＝A×B×32.2××n×2 式中　 X——糖化酶活力（u/mL） A——根据OD值查出的葡萄糖量 B——吸取稀释后糖化液2 mL，换算为1 mL，即1