溶葡萄球菌酶復合剂体外抗猪大肠杆菌研究.docVIP

溶葡萄球菌酶复合剂体外抗猪大肠杆菌作用检测 本研究为委托检测，按照委托方要求进行试验。 一、材料 待检样品：由委托方提供，编号分别为1＃、2＃、3＃和4＃，外观为白色粉未。另购商品级饲料添加用溶菌酶复合剂作为对照，编号5＃。 培养基：MH肉汤和药敏试纸，购自杭州天和生物试剂公司。MH肉汤琼脂平板，按说明书方法配制。 试验菌株：EC-130和EC-142大肠杆菌购自上海卫生防疫站，同时产不耐热肠毒素（LT）和耐热肠毒素（ST）。193＃、LT8-1、LT16-1、LT9-2、ST13-1、LTST9-1、LTST12-1大肠杆菌分离自临床腹泻仔猪，产不耐热肠毒素（LT）或／和耐热肠毒素（ST）。 二、方法 1、抑（杀）菌作用试验 纸片法：　称取各样品适量，溶于灭菌蒸馏水中成2％或10％浓度，滴加于直径5mm的灭菌滤纸片上，每片约含2ul药液，阴凉干燥，4℃贮存备用。分别取EC-130和139＃菌株接种于2毫升MH液体培养基中，37℃培养过夜。取过夜培养的新鲜菌液适量，稀释后取0.5毫升均匀涂布于MH平板。待平板表面菌液完全吸收无积液后，贴加各样品纸片试样，倒置37℃培养过夜，测量抑菌圈直径的大小，判定结果。 2、抗菌素抑（杀）菌比较试验 纸片法：实验方法同上，试验菌株为EC-130。根据抑（杀）菌作用试验结果，选取3＃和4＃样品进行对比试验，同时贴加不同的抗生素药敏纸片。 3、最低抑（杀）菌浓度试验 试管法：取灭菌的MH液体培养基，将各待检样品稀释成不同含量，每管2ml，分别每管接种37℃培养过夜的EC-130和139＃大肠杆菌5ul，再37℃培养过夜，观察各试管细菌生长情况。完全抑制细菌生长的最高稀释培数为试验样品的最低抑菌浓度。 4、不同作用时间的抑（杀）菌效率试验 试管法：取37℃过夜培养的EC-130和139＃菌株，用MH培养液稀释成1OD，分别加入各待检样品，使成最低抑（杀）菌浓度，37℃培养并立即计时。分别在作用5和8小时取样，作连续10倍稀释。定量取适当二个连续稀释度菌液0.5毫升，均匀涂布于MH平板，每个稀释度重复二次，待平板表面菌液完全吸收无积液后，倒置37℃培养过夜。计数每平板菌落数量，与不加药液的细菌数量对照，计算各时间点各待检样品的抑（杀）菌率。 5、临床分离的致病性大肠杆菌抑（杀）菌试验 试管法：将7株猪场临床分离的致仔猪腹泻大肠杆菌分别接种于2毫升MH液体培养基中，37℃培养过夜。取灭菌的MH液体培养基，将各待检样品系列稀释成不同含量，每管2ml。将每株37℃培养过夜的大肠杆菌，分别接种每种系列稀释的试验样品管中，每管接种菌液5ul，再37℃培养过夜，观察各试管细菌生长情况。完全抑制细菌生长的最高稀释培数为试验样品的最低抑菌浓度。 三、结果 （一）抑（杀）菌作用试验： （1）1和2号样品对EC-130和193＃大肠杆菌均无任何抑菌作用； （2）3和4号样品对EC-130大肠杆菌均有抑菌作用，3号样品抑菌圈直径约20mm，4号样品抑菌圈直径约9mm。 （3） 4号样品对193＃大肠杆菌也有明显的抑菌作用，抑菌圈直径均为约9mm。而3号样品对193＃大肠杆菌无抑菌作用。 EC-130大肠杆菌　　　　　　　　　　　193＃大肠杆菌 （二）抑（杀）菌效果与部分抗菌素比较试验： 3号样品对大肠杆菌的抑菌圈直径与庆大霉素、先峰V号和丁胺卡那相似，大于多粘菌素，但小于环丙沙星。4号样品的抑菌圈直径均小于试验所用抗菌药物（见下表和图）。 药物名称 抑菌圈直径(mm) 环丙沙星 36 庆大霉素 18 丁胺卡那 18 先峰V号 20 多粘菌素 13 3＃样品 22 4＃样品 8 （三）最低抑（杀）菌浓度试验： 各样品最低抑菌浓度为2号0.25mg/ml、3号0.5mg/ml、4号0.13mg/ml、5号1.0mg/ml 样品 2.00mg/ml 1.00mg/ml 0.50mg/ml 0.25mg/ml 0.13mg/ml 0.06mg/ml 0.03mg/ml 2 － － － － ＋ ＋ ＋ 3 － － － ＋ ＋ ＋ ＋ 4 － － － － － ＋ ＋ 5 － － ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ 注：－表示细菌不生长，＋表示细菌生长。 （四）不同时间的抑（杀）菌效率试验 用无抗药性的标准大肠杆菌（EC-130）进行试验，3号样品和5号样品在2.5小时内杀菌效力可达75.7-87.7%，而2号样品和4号样品的杀菌效率仅25.5-33.0%。 样品 稀释度 0小时 0.5小时 1小时 2.5小时 计数 杀菌率 计数 杀菌率 计数 杀菌率 计数 杀菌率 2号样 105 828 539.5 34.9% 644 22.2% 555 33.0% 3