灰度值和光密度值在免疫組化定量分析.docxVIP

灰度值和光密度值在免疫组化定量分析免疫组化技术现在是很成熟的方法，但是对免疫组化照片的分析并没有一个权威的说法。现在可以查到无数篇应用图像分析来分析免疫组化的文献，但几乎没有哪一篇能详细地叙述分析的过程与方法。首先，免疫组化的样品应该是用ＤＡＢ对免疫组化产物染色，同时用苏木对细胞核进行复染。镜下观察样品，细胞核被染上了蓝色，胞浆间有黄色（强阳性的地方会呈现棕黄色）。居然经常能看到其他颜色的免疫组化照片，这肯定是样品制作过程中有了差错。用肉眼观察免疫组化切片的结果只能是定性的，不准确的。使用图像分析软件定量地（至少是半定量）对照片测量出一个数值来自然比用肉眼看更准确。切片上阳性反应物量是由图片上黄色染色的深浅与面积一起表现的。所以最终要测量的就是图片上黄色部分的累积光密度（IOD），这是个没有单位的相对数值。就是把图片上每个黄色的象素点的强度值全部累加起来得到的值。IOD除以一个适当的面积，就是一个平均光密度。这个面积可以就是照片的面积，也可以是照片上一个组织区域的面积，或者是有黄色的区域的面积。必须根据切片的实际情况来适当选择。对于细胞核的免疫组化切片，在细胞核上，由于有蓝色复染，所以需要另一种分析方法。将另作讲解。这张照片曝光稍大。但仍能表现出免疫组化的黄色染色与细胞核的蓝染。在拍摄照片时，需要注意的地方是：１.所有的照片必须以同样的显微镜环境与拍摄条件来拍摄。在拍摄照片时，要保持显微镜光源亮度的稳定，用同样的曝光时间拍摄照片。在更换视野或切片时，除了对焦距这个操作外，其他所有的操作都不能有变化。强阳性的样品就是暗的黄的，弱阳性的样品则亮一些，阴性样品就是一片白。这样才能测量出正确的密度值。２.曝光的选择：试拍摄一张空照片，看一下白色背景的亮度，应该在２３０附近。过低过高都不好。3.注意相机白平衡：如果使用的是专业CCD相机，会有校正白平衡的功能，此时应对空视野进行白平衡校正。如果是普通的数码相机，要关闭自动白平衡功能。或者选择阳光模式。避免拍摄的照片因为色偏而偏蓝或偏黄。4.很多显微镜都是同时有荧光附件的，在拍摄荧光照片时要加上滤光片，注意有时候这些滤光片会忘了移开，结果拍摄的照片就会严重偏色。正确地拍摄照片是图像分析的基础，以后的各项应用实例中往往都会先介绍如何拍摄照片。图像分析方法：1.校正图片光密度分析免疫组化照片，第一步就是要校正光密度。照片上黄色点的亮度数值是灰度，黑色为0，白色为255.这与免疫组化强度是相反的。深色深的点，数值应该更大才对。在理论上，图片上的灰度与样品阻挡光线的物质光密度是一个指数关系，对于白色的色点，对应样品透光率为100%，光密度为零。对于黑色的点，对应样品透光率为0，光密度为无穷大，但实际上把这个光密度值定为2.0.校正光密度值就是把程序的光密度值设置成这样的坐标。在carliberation intensity的窗口里点new,然后选择std option density.把鼠标放在图片上最白的地方，然后看程序窗口下方的状态栏，会有显示该点的三色各自的灰度值，在其显示的数值中间选择一个差不多的整数，比如230，或220，作为背景扣除值。操作方法是：点option按纽，在弹出的小窗口中的incident level中把默认的255改为230或220.返回就可以了。最后在窗口右上方点一下system把这个校正作为系统光密度值应用于所有图片。这个设定被默认地命名为intensity cal 0 。光密度校正的窗口不要关闭，可以移到边上放着随时检查。有时候新照片未必会应用上，要重新调出刚才设定的intensity cal 0.2.选色。在segmentation中使用HSI模式，选择H:0-30,S:0-255,I:0-230.然后点file -- save。HSI的选择范围是可以根据图片情况作微调的。保存这个选色设置。一般放在图片的保存文件夹里。默认的保存文件是rgb24.rge。3.设置分析环境。一个是select measurement。要选择IOD。另外默认的选择area都是要测量的。对area的过滤值，默认为10，实际上还可以大点，设置到25甚至50也行，可以把那些小的杂质点去掉。另一个是option:outline :filledlabel style :nonedark background on sample :nosmoothing=1filled hole:onclean border : none4.保存分析环境。在count/size窗口中点file save settings。保存环境设置文件。5测量用irregular工具画出测量区域。这里很关键的一点就是如何画这个测量区域。最普通的情况下，要测量整张照片的光密度，就不必画这个测量区域了。此时会测量照片上全部被选中的