创新课题实践报告.doc

课外科研创新实践总结 1 对科研课题的认识 微生物发酵法生产L-鸟氨酸，实际上就是借助微生物具有合成自身所需氨基酸的能力，选育出营养缺陷型并带有某些结构类似物抗性标记的突变株，以解除代谢调节中的反馈抑制和反馈阻遏作用，从而达到过量积累L-鸟氨酸的目的。再通过优化发酵工艺，使L-鸟氨酸产量达到最大值。 1.1对鸟氨酸的理化性质及生物功能的认识 L-鸟氨酸难以结晶，通常是浆状物。易溶于水、乙醇，微溶于乙醚。能够电离成为两性兼性离子，能够和酸和碱发生特性反应，能和甲醛、茚三酮等发生反应。通常作为试剂使用的是其单盐酸盐，L-鸟氨酸单盐酸盐易溶于水，不溶于甲醇、乙醇、乙醚 。L- 鸟氨酸存在于生物体多种组织和细胞中，具有生物活性，在生物体代谢中起到重要作用。鸟氨酸在医学和食品工业中起到重要的作用。是尿素生成的中间产物，精氨酸、瓜氨酸等多种氨基酸代谢的前提物质，主要参与产尿素的鸟氨酸循环中，对体内集聚的氨具有解毒作用，因而鸟氨酸对人体肝脏细胞具有重大意义。在近代医药行业，L- 鸟氨酸除用于制备保肝、护肝、治疗肝病、 抗疲劳、抗虚弱等各种复方氨基酸输液外，还常和精氨酸一起用于配制恢复疲劳的发泡饮料。L-鸟氨酸因其多功能的保健作用而引起世人的特别关注。 1.2对鸟氨酸生产的认识 生产鸟氨酸的方法有提取法，化学法，微生物法和酶法4种方法。其中提取法制备成本高，提取工艺繁琐；化学法中合成收率低，有机物合成过程中会产生致癌物，还会合成手性分子，拆分工艺难度大；酶法是精氨酸在精氨酸酶的作用下，生成L-鸟氨酸，此法产品纯度高，但价格昂贵，精氨酸及精氨酸酶均不易获得，限于实验室制备。发酵法生产的鸟氨酸，全是L型，产品以鸟氨酸的盐酸盐形式存在。此法简便易行，只要选择合适的菌种，可以达到较高的产量，适用于工业化规模生产。 1.3对L-鸟氨酸的生产菌株的认识 目前，利用发酵法生产L-鸟氨酸的出发菌株主要有谷氨酸棒杆菌的精氨酸缺陷型突变株；乳酸发酵短杆菌、川崎短杆菌、柠檬酸节杆菌等的精氨酸缺陷型突变株；枯草杆菌、大肠杆菌、帕特介里编型杆菌的瓜氨酸缺陷性突变株；解烃棒杆菌和一种石蜡节杆菌的精氨酸缺陷性突变株；洁白链霉菌的瓜氨酸和硫胺素双重缺陷型突变株。但是，用的最多的还是谷氨酸棒杆菌营养缺陷型菌株。L- 鸟氨酸的生产菌种多是通过菌种选育得到，选择合适的出发菌株，利用紫外线和亚硝基胍等诱变方法，筛选出L-鸟氨酸的高产菌种。生产菌大都是精氨酸或瓜氨酸的营养缺陷型的棒杆菌及短杆菌（因为鸟氨酸属于胞内氨基酸，菌体内鸟氨酸进一步合成精氨酸，要使其积累鸟氨酸，可以阻止鸟氨酸的下行合成途径，只要通过筛选瓜氨酸和精氨酸缺陷型菌株就能实现）。 1.4关于L-鸟氨酸生产的研究 1957年, Udaka利用谷氨酸棒杆菌的瓜氨酸缺陷型突变株来生产鸟氨酸, 在含限量要求物质精氨酸的培养基中培养, 成功地蓄积了大量的鸟氨酸, 开创了应用营养突变株发酵生产氨基酸的方法。此后, Okumura和Shibuya等人在这方面也做了大量的工作, 总结出了具有精氨酸缺陷型及精氨酸氧肟酸盐抗性的谷氨酸棒杆菌以及具有精氨酸缺陷、 瓜氨酸缺陷和霉酚酸抗性等标记的柠檬酸节杆菌突变株在发酵法生产鸟氨酸工业上的应用。他们的研究成果几乎都以专利文献的形式发表，而在国内尚未有人做过这方面的研究。鸟氨酸的生产也以日本为主，生产厂家主要有味之素、田道制药和协和发酵等3家。目前，鸟氨酸仅在日本的市场规模就达15亿日元，且其需求量正在不断上升。但鸟氨酸的生产却极为不易，日本在80年代末也还在采用以精氨酸为原料，经碱法水解或利用精氨酸酶水解得到鸟氨酸。1988年, Katsumata Ryoichi, Yokoi Haruhiko 等将编码N-乙酰谷氨酸激酶、N-乙酰谷氨酸-? -半醛脱氢酶等酶基因片段从质粒 PE Arg 1 中切割下来, 再将其连接到 PE Arg 2 质粒中，导入这种重组质粒的谷氨酸棒杆菌产鸟氨酸可以达到21 g/ dL。 2课题研究目的与意义 2.1目的 鸟氨酸生产菌株对L-鸟氨酸产量的大量积累主要包括以下两个方面：一方面，从微生物代谢机理角度考虑，解除代谢机制中的反馈抑制与反馈阻遏，可使制备过程向着鸟氨酸高产的方向进行；另一方面，从鸟氨酸积累的发酵环境考虑，优化突变菌株发酵时的培养条件，如培养基组分及浓度，碳氮源，无机盐及生长因子等；发酵条件如温度、pH和溶氧水平及摇床发酵优化，可提高L-鸟氨酸产量。所以从这两方面出发，寻找最适合的发酵生产菌株及优化发酵工艺就是这次科研的目的。 2.2意义 近年来，由于氨基酸在医药、保健品、日用化工等方面有极其广泛的用途，尤其随着抗癌药物制剂、氨基酸营养制剂的飞速发展，对原料氨基酸的需求量日益增长，市场需求量不断增加。鉴于L-鸟氨酸的国内外市场的供需状况以及发展民族氨基