《微加工技术.docVIP

7.2 与生物芯片制备相关的微加工技术 一提起“生物芯片”，人们很自然就会联想到近几十年来曾使我们的生产和生活发生重大变化的集成电路芯片，因此也常常把它理解为一种利用生物分子实现计算和数据处理功能的芯片。的确有不少人在进行这种生物计算机的研究，但我们这里所说的生物芯片是指目前发展非常迅速的一项热门技术。它与集成电路芯片有着本质区别：它处理的并不是电信号，也不具有运算功能，而是一种以生物分子为处理对象、执行生化分析检测的微型设备。不过二者还是有很密切的联系，除了都有集成化、微型化、可对信号进行并行处理等特点以外，它们在制作工艺和材料方面也很相似。生物芯片的制备所依赖的正是集成电路工业中应用十分成熟的光学光刻技术（photolithography）和微机电系统(Micro Electromechnical System, MEMS)及其他精密仪器加工中所采用的各种微细加工方法，如反应离子刻蚀(Reactive Ion Etching)、LIGA(Lithograghie, Galvanoformung und Abformung) 技术 、激光切削/打孔（Laser Ablation/Drilling）压模（Imprinting Method）, 微注（Microinjection Molding热塑（Hot Embossing）[1]，在这里我们把它们统称为微加工（Microfabrication）技术。 简单地说，生物芯片是指能对生物分子进行快速并行处理和分析的厘米见方的固体薄型器件[]。按其结构及工作机理微阵列芯片（Microarray chip和微流芯片(Microfluidic chip)微阵列芯片μTAS）或缩微芯片实验室（Lab?–on-a-chip）。两种技术间虽有少量交叉但基本经历了各自独立的发展过程。由于生物反应多种多样，而不同的生物反应需要在不同的材料中进行，为了能够在芯片上完成这些反应，制作芯片的材料就必须多种多样，硅、玻璃塑料[4]。这其中，硅是常用的一种材料，这是由于在微电子领域，人们已经摸索出了一整套成熟的硅加工工艺。对于需要温度控制的生物反应，例如聚合酶链式反应（polymerase chain reaction, PCR），链置换扩增（strand displacement amplification, SDA），由于硅具有良好的导热性，更是成为人们的首选。但是硅的缺点是不透明，不利于光学检测，并且具有一定的导电性，尤其是具有比较强的表面非特异性吸附。因此在制作毛细管电泳芯片时，人们一般不选用硅，而选用玻璃或者塑料。在使用生物芯片时，必须考虑到生物相容性问题，而玻璃、塑料表面所具有的各种功能基团使其很容易进行化学修饰，从而使其生物兼容性大大提高。因此有许多种芯片是用玻璃或者塑料制作的[5] [6]。 7.2.2[7]。 美国Affymetrix公司采用的半导体光刻原位合成法[8]，是把半导体工业中的光刻技术和DNA的化学合成方法相结合，把光不稳定保护基团保护的四种DNA模块固定在玻片上，通过光脱保护，由少量的保护寡核苷酸和试剂按照设计的序列进行DNA合成。 该方法的主要优点是可以用很少的步骤合成大量的探针阵列，合成速度快。例如：合成48（65536）个探针的8聚体寡核苷酸全序列仅需要4×8＝32步，8小时就可以完成，而如果用传统方法合成然后点样，则工作量的巨大是不可思议的。同时，用该方法合成的探针阵列密度可高达106/cm2。但它也存在一些缺点，如合成反应产率较低，不到95％以上；探针长度较短，且每步去保护不很彻底，会导致杂交信号比较模糊，信噪比降低，为此有人用电子射线核酸作为保护剂，以提高产率及点阵密度。此外，掩模的制造十分繁杂，既费时，又昂贵，也是其缺点之一。 另一种是美国Incyte Pharmaceutical公司采用的压电打印法（Piezoelectronic printing）进行原位合成[9]。其技术原理与喷墨打印机相似，有打印机头在方阵上移动，在方阵每点上电流使喷头放大，并将装有某种碱基的试剂滴出μl到芯片表面，然后固定。在洗脱和去保护后，另一轮寡核苷酸的延伸就可继续进行。合成的探针可达40－50mer，每步产率可达99％。压电印刷法由于不需要与载体表面直接接触，故有很高的效率，但制造工艺还不太成熟。 合成点样法是采用传统的分子生物学合成所需的DNA探针，通过特定的高速精密机器手直接点在芯片上。Stanford大学首创的接触式点涂法[10]就是通过使用高速精密机械手所带的移液头与玻璃芯片表面接触而将探针定位点滴到芯片上的。常用的机械手有一套计算机控制的三维移动装置，多个打印头/碰印头、一个减震底座，上面可放内盛探针的多孔板和多个芯片。根据需要还可以有温度和湿度控制装置、针洗涤