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生物工程上游技术综合设计实验 利用不同的方法筛选和鉴定转化子 生命科学学院 生物工程09级1班 同组成员： 指导教师： 摘要：通过转化子筛选、菌落直接PCR、重组质粒大小鉴定、重组质粒酶切鉴定、重组质粒的进一步PCR鉴定等一系列步骤，我组成功筛选并鉴定了含有pET32-CaM5转化子的两个菌落，基本掌握了转基因生物筛选鉴定的基本方法。 关键词：转化子；筛选；鉴定；PCR；凝胶电泳 引言：在质粒载体上进行克隆时，由于量少，连接产物没有也不可能再经过分离纯化而获得纯的重组质粒，连接产物中混有载体自连而成的空载体、载体与目的片段连接而成的目的重组质粒和载体与非目的片段连接而成的非目的重组质粒。同时，细菌（宿主）的转化效率极低，即转化实验后绝大部分细菌（宿主）是没有被转化的，因此有必要对转化产物进行筛选和鉴定。首先，通过抗生素抗性从转化后代中筛选出转化子。然后，通过菌落直接PCR从转化子中筛选出候选转基因生物。最后，从候选重组子中提取质粒。 使用仪器、材料 材料 实验九装备好的转化产物：含pET32-CaM5 或pET32的E. coli DH5α菌株（R—，M—，Amp—） 设备用具 PCR仪、恒温摇床、台式高速离心机、恒温水浴锅、琼脂糖凝胶电泳装置、电热恒温培养箱、电泳仪、超净工作台、微量移液抢、eppendorf管（1.5mL离心管）等。 主要试剂 大肠杆菌培养试剂、质粒提取试剂、酶切试剂、PCR反应试剂、电泳试剂以及其他常规试剂。 实验步骤 转化子筛选（已做） 每组连接反应转化原液取100μL用无菌玻璃棒均匀涂布于筛选培养基上，37℃下培养半小时以上，直至液体被完全吸收。 倒置平板于37℃继续培养12~16h，平板上所长出的单菌落即为转化子。因为不带质粒的细胞无Amp抗性，不能在含有Amp的培养基时成活。 菌落直接PCR 用无菌牙签分别挑取4个白色转化子菌落和一个已知的pET32- CaM5菌落，先在编好号的5支PCR反应管中的底部分别涂搽，然后点在新的含有Amp的筛选平板上，在其背面编号，置37℃过夜后保存于4℃。在PCR反应管中加入PCR反应混合液，进行PCR反应。 PCR反应混合液的配制 (50μl) 10 x PCR buffer 5μl dNTP mixture 4μl 前向引物 (P1) 2μl 反向引物 (P2) 2μl rTaq酶 0.5μl 灭菌蒸馏水 36.5μl （注：dNTP mixtures：dATP, dTTP, dGTP, dCTP 各2.5mM 前向引物(10uM)为： 5’-CGCGAATTCATGGCAGATCAGCTCACCGATGATC-3’ 反向引物(10uM) 为： 5’-AGAGCGGCCGCCTTTGCCATCATAACTTTGACAAA-3） 所有试剂按量仔细添加后，轻轻混匀，稍离心后即可，然后分为5份，每份10μl加入上述5支PCR反应管。为了防止反应混合液蒸发，每份可添加20μl矿物油覆盖。 PCR仪的参数设置 94℃ 2 min 94 ℃ 30sec 35 cycles 62 ℃ 30sec 72 ℃ 30sec 72 ℃ 5 min 琼脂糖凝胶电泳检测 反应结束后，取5μl PCR产品，加入1μl 6或10 x loading buffer，混匀后点样，电泳15min，观察产品的大小。 重组质粒大小鉴定 用无菌牙签从上述新的筛选平板上挑取PCR反应阳性菌落①、②，接种于含Amp 50μg/mL的5mL LB液体培养基中，37℃下振荡培养12h。 配制试剂： 溶液I：50 mM葡萄糖，10 mM EDTA，25 mM Tris-HCl（pH8.0），用前加溶菌酶4 mg/L； 溶液II：NaOH溶液（内含1% SDS）：0.2 M； 溶液III（pH4.8）: 60 mL 5 mol/L醋酸钾，11.5 mL 冰醋酸，28.5 mL H2O；