切片主要步骤.docx

切片法主要步骤 1、取材与固定（1）取材：从动物体取下所需的器官材料。取材的动物要健康，材料愈新鲜愈好，应在致死后立即取材，防止组织细胞自溶变性；取材的器械要锋利；所取材料力求小而薄（以不超过0.5cm为宜），不能挤压和损伤。（2）固定：将所取的材料立即投入固定液中，目的是使组织蛋白迅速凝固，使细胞内的结构和成分不再发生变化，保持组织细胞与活体相似的形态结构，固定后的组织块变硬，便于进一步处理。常用的固定剂有甲醛、乙醇、苦味酸或混合固定液。实验室常用Bouin固定液，固定时间为12～24小时，其固定的组织块不需进行水洗，可直接进行脱水。2、脱水与透明（1）脱水：固定后的组织块内含有的大量水分要彻底脱去，以便石蜡的浸入。常用的脱水剂为乙醇，脱水过程必须循序渐进，从低浓度开始，逐步升高，使组织块中的水分逐渐被乙醇所取代。具体操作为：Bouin固定液固定的组织块可直接进入70％的乙醇进行脱水，时间12小时左右。（若材料暂不制片，可保存于70％乙醇中。）然后将组织块依次移入85％乙醇（Ⅰ）、（Ⅱ）各8-12小时，→95％乙醇（Ⅰ）、（Ⅱ）各2小时，→100％乙醇（Ⅰ）、（Ⅱ）各1小时。因无水乙醇对组织有脆化作用，故在无水乙醇中时间不能超过2小时（2）透明：100%酒精＋二甲苯(1:1)30-40分钟，二甲苯（Ⅰ）15分钟→二甲苯（Ⅱ）15分钟（易脆的组织可省略）。二甲苯的收缩性强，极易使组织变脆，透明时间根据不同的组织适当调整。3透蜡：二甲苯 ＋石蜡（1:1）30分钟，石蜡（Ⅰ）40分钟→ 石蜡（Ⅱ）30分钟 浸蜡是将包埋剂取代二甲苯渗透入整个组织的过程,通常在恒温箱中进行,恒温箱的温度应该设置成高于石蜡熔点2～3℃。浸蜡的时间长短根据不同的组织器官适当调整。4包埋 5切片：将凝固的蜡块修整成合适的方块，上下边要平行，并固定在小木块上，切片厚度6-12um，一般7-8um。切片刀倾斜角一般以20—30度为宜，切片时力要均匀一致，以每分钟40-50转为宜。夏季切片时,为保持蜡块硬度，可把蜡块放于冰柜中,切片时再取出；胶质成分较多的组织蜡块,切片时可以用毛笔沾水往冷却过的蜡块滴加后再切片,以保证切片的完整性。如果发现切片破碎可能的原因有:组织过硬变脆,可能是由于脱水时间不适当,可先用温水润泽,再用冰硬化,便可较顺利地切片；也可能由于浸蜡时温度过高,造成组织过硬。6贴片：用洁净的纯净水（易掉片的用甘油蛋白）贴片，放在45-50℃左右（比石蜡的熔点略低，根据气温适当调整）左右烘片台展平，入50℃的干燥箱中烘干备用。7染色：二甲苯脱蜡（Ⅰ）(10-20分钟，可长时间) → 二甲苯脱蜡（Ⅱ）(10-20分钟，可长时间) →以下每步2-5分钟，也可长时间 二甲苯：无水酒精1：1→无水酒精（Ⅰ）→95％酒精→90%酒精→80％酒精→70％酒精→蒸馏水→苏木精或伊红染液(20-24分钟)→自来水冲洗 →蒸馏水(2-5分钟)→1％盐酸酒精（70%酒精＋1%盐酸，在其中蘸取几下）（然后蒸馏水中沾洗几次，清除盐酸，防止下一步中和碱水）→1%碱水（3-5秒）至组织出现蓝色（目的：显蓝）→蒸馏水(2分钟)→70％酒精 (2分钟)→80％酒精(2分钟)→90% 酒精（2分钟）→95%酒精（2分钟）→0.5－1%的伊红染液复染(几秒至数分钟，根据伊红浓度和组织不同而定，注意染色时间不能太长,3-5秒)→95％酒精（Ⅰ）(分色2分钟或更长，至胞浆和结缔组织等成桃红色)→95％酒精(Ⅱ) (2分钟)→无水酒精（Ⅰ）(2分钟)→无水酒精(Ⅱ) (2分钟)→二甲苯（Ⅰ）(2分钟)→二甲苯(Ⅱ) (2分钟) 不同的生物及不同的组织以及相同组织的不同生理阶段对染料的亲和力都有差异，所以分色和蓝化时间需要摸索，可在显微镜下观察。染色结果细胞核蓝紫色，胶原纤维、肌纤维、嗜酸性颗粒桃红色，胞浆桃红色，弹性纤维明亮桃红色。8封固：中性树胶用二甲苯稀释，以能用吸管吸起为准，先将盖玻片一侧放置在滴有中性树胶的组织切片上,随后缓慢放下并将空气完全排除,避免留下气泡。斜面放置晾干。9观察和照相：在显微镜下观察，对好的视野拍照，做好记录。