精·PCR技术概述.ppt

* RT-PCR可以一步法或两步法的形式进行。 在两步法RT-PCR中，每一步都在最佳条件下进行。cDNA的合成首先在逆转录缓冲液中进行，然后取出1/10的反应产物进行PCR。 在一步法RT-PCR中，逆转录和PCR在同时为逆转录和PCR优化的条件下，在一只管中顺次进行。 * 逆转录酶 ＤＮＡ聚合酶 mRNA cDNA 杂化双链 PCR扩增 * * 9) 荧光定量 PCR（real-time PCR) 通过荧光染料或荧光标记的特异性的探针,对PCR产物进行标记跟踪,实时在线监控反应过程,结合相应的软件可以对结果进行分析,计算待测样品的初始模板量。 荧光定量 PCR仪 光定量PCR仪是一种带有激发光源和荧光信号检测系统的PCR仪,通常配有电脑系统及相应的分析软件。 * 荧光定量实时PCR与普通PCR的比较 实时在线监控 对样品扩增的整个过程进行实时监控,能够实时地观察到产物的增加,直观地看到反应的对数期 降低反应的非特异性 使用引物和荧光探针同时与模板特异性结合,提高了PCR反应的特异性 增加定量的精确性 全程监控,准确的算法进行定量 结果分析更加快捷方便,无需跑胶 * 全新4通道实时荧光定量PCR仪 普通梯度PCR仪 * （3）GC的含量 一对引物的GC含量和Tm值应该协调， G+C一般占40-60%。 根据公式Tm=4（G+C）+2（A+T）,可估计引物的Tm值。 * （4）两引物间避免有互补序列，尤其避免3’端的互补重叠。 一般来讲，引物自身连续互补碱基不能超过3个，一对引物间也不易多于四个连续碱基的互补性。 * （5）碱基的随机分布 选择缺乏连续单一核苷酸的区域作为引物序列，这样可以减少引物-引物同源互补的机会。 也要注意引物在长度和碱基组成上的平衡，两个引物的Tm值相差2-3℃范围内。 * （6）引物内部避免形成二级结构。 采用计算机软件可以预测估计mRNA的稳定的二级结构，有助于选择模板。 * Ⅲ引物浓度 0.1-1 ?mol/L 引物浓度过低，PCR产物量下降。 浓度过高易导致模板与引物错配,反应特异性下降，还会增加引物二聚体的形成。 非特异性产物和引物二聚体又可作为PCR反应的底物，与靶序列竞争DNA聚合酶和dNTP底物，使靶序列的扩增量降低。 * （3）循环参数 Ⅰ变性的时间与温度 不同的DNA解链温度不同，由于DNA中GC与AT的比例不同引起的。GC比例越大，解链温度越高。 一般GC含量每增加1%，解链温度就增加0.4℃。 典型的变性条件是95 ℃30s或97 ℃15s。 * 过高使聚合酶失去活性，过低DNA变性不完全。 变性温度在90-95 ℃时，既能保证使DNA双链模板变性，又能保持Taq聚合酶活力。 因此PCR变性温度在90-95 ℃之间选择，时间为30-60s。 * Ⅱ退火时间与温度 退火温度决定着PCR的特异性。 引物复性所需的温度与时间取决于引物的碱基组成、长度。范围一般在25-65℃，低于引物Tm值5 ℃ 左右。 在典型的引物浓度时，退火时间一般为40-90s，过短会导致引物与模板DNA互补配对失败。 * Ⅲ延伸时间与温度 延伸时间的长短取决于待扩增的模板序列的长度与浓度，以及延伸温度高低。 引物延伸在70-74℃下进行，根据扩增DNA的长度而确定，一般延伸30-90s。 * Ⅳ循环次数的确定 以既达到扩增效果又尽量减少非特异性产物的扩增为原则，PCR的循环次数一般在25-35次。 循环系数过多将增加非特异产物；循环次数太少，产率偏低。因此在得到足够产物的条件下应尽量减少循环次数。 * 经典循环参数（500bp以内） 94℃ 30s 55 ℃ 45s 72 ℃ 1min 94℃ 5min ×30次 72℃ 7min 4℃ forever * （4）Taq DNA聚合酶（thermus aquaticus 0.5-2.5 U/50 ?l 酶量增加使反应特异性下降;酶量过少影响反应产量。 催化DNA合成的温度以70-80℃为宜。高于90℃时，DNA合成几乎不能进行。 * （5） Mg2+ Mg2+是DNA聚合酶的激活剂。 0.5mmol/L-2.5mmol/L反应体系。 Mg2+浓度过低会使Taq酶活性丧失、PCR产量下降； Mg2+过高影响反应特