《药品微生物限度测定.docxVIP

含抑菌成分的中成药的微生物限度检查，必须消除供试液抑菌活性后，再根据中国药典规定的方法进行检查，同时，所采用检测方法需进行验证试验，以确认供试品的抑菌活性和保证测定方法的可靠性。因此，现行中国典收载的各中成药品种检查项下，很少规定具体的微生物限度检查方法。根据国家药典会的要求，中国药品生物制品检验所抗生素室和青岛市药检所微生物室，对2005版药典拟收载的16种中成药品种微生物限度检查法进行方法验证，为规范中成药的微生物限度检查法提供科学依据。材料和方法 1、材料 1.1仪器设备净化工作台、恒温培养箱（30～35℃）、生化培养箱（25～28℃）、微波炉、康氏振荡仪、匀浆仪（300～8000r/min）、恒温水浴、电热干燥箱（250～350℃）、电冰箱、空调、高度蒸汽灭菌器、集菌仪、离心器、菌落汁数器、显微镜（1500x）、电子天平（感量0.1g）、免接触自动控制手消毒器 1.2玻璃器皿锥形瓶（250～300ml）、平皿（9cm）、量筒（100m）、试管（18×180mm）及塞、吸管（1ml分度0.01，10ml分度0.1）、注射器（20或30ml）、注射针头、载玻片、可折卸滤器及微孔滤膜（0.45μm）均于160℃干热灭菌2h或高压蒸汽121℃灭菌30min，烘干备用 1.3用具一次性无菌衣、帽、口罩、手套、大、小橡皮乳头（放于干净带盖的容器中，并定期用70%～75%，乙醇溶液浸泡）、接种环（白铱金、环径4～5mm、长度6～10cm）、乙醇灯、乙醇棉球及碘伏棉球、灭菌剪刀、灭菌镊子、不锈钢药匙、试管架、火柴、记号笔、白瓷盘、研钵（陶瓷制、直径10～12cm）、洗手盆、实验记录纸等。 1.4试液 1.4.1消毒液 0.1%苯扎溴铵溶液（供洗手、擦拭操作台面用），5%石碳酸溶液（配好后装入玻璃消毒缸内供消毒带菌吸管用）75%乙醇溶液、碘酊、碘伏溶液。 1.4.2稀释剂 0.9%无菌氯化钠溶液（稀释供试液及菌液用） 1.4.3培养基营养琼脂培养基、玫瑰红钠琼脂培养基、酵母浸出粉胨葡萄糖（YPD）琼脂培养基、硫乙醇酸盐琼脂培养基 1.4.4染色剂甲紫染液（Hucker液）、革兰碘液、脱色液、番红复染液 1.5样品厂家批号感冒清热颗粒南宁维威制药 630801 黄连上清丸陕西香菊制药 030202 牛黄上清片佐今明制药 021202 感冒清片广东罗浮山药业 030804 热炎宁颗粒贵阳润丰制药 030401 清开灵口服液山西太行药业 030904 清喉利咽颗粒山西桂龙医药 030511 千柏鼻炎片广东博罗先锋药业 020301 藿香正气滴丸天津天士力制药公司 030340 三黄片山西杨文水制药厂 030222 清热解毒口服液江西新余制药厂 030422 板兰根冲剂四川奇力制药有限公司 030422 复方丹参片巢湖正大药业有限公司 020401 牛黄解毒片上海正大药业有限公司 031125 三七伤药片上海雷允上药业有限公司 030760 双黄连口服液上海三洋药业健康产品有限公司 0301221 购自北京和青岛两地医药商店 1.6试验菌金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）[CMCC(B)26003] 大肠杆菌（Escherichia Coli）[CMCC(B)44102] 枯草杆菌（Bacillus Sulticis）[CMCC(B)63501] 白色念珠菌（Candida albicans）[CMCC(F)98001] 黑曲霉菌（Aspeigillus niger）[CMCC(F)98003] 来自中国医学细菌保藏中心 2、方法 2.1菌液的制备取经37℃培养18～24h，金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、枯草杆菌肉汤培养基1ml及20～25℃培养18～24h的白色念珠菌真菌液体培养物+9ml盐水为0倍稀释，以此类推，稀释到10-4～10-7为50～100个/ml做活菌计数备用，取经20℃～25℃培养一周的黑曲霉斜面培养物、加水3～5ml，洗下霉菌孢子，用带有棉花的球形吸管取出菌液，用标准比浊管比浊后，稀释为50～100个菌做活菌计数备用。 2.2供试液制备各种样品浓度均为1∶10供试液，分别加入上述5种试验菌株。 2.3培养基稀释法采用1ml供试液加三个平皿或五个平皿，每个平皿加15～20ml琼脂培养基做细菌计数，测定回收率。 2.4离心集菌薄膜过滤法分别取不同的1∶10供试液10ml移到灭菌的离心管中，以500转/分离心5分钟后，取上清液1ml加入薄膜过滤器中，冲洗液300ml/膜，后取膜贴于琼脂平板，置适宜的温度培养24～72h观察结果。 3、回收率测定 3.1供试品组取1∶10供试液加入菌液使50～100cfu/ml试验菌立即倾注琼脂培养基，平行置备两个平皿，按中国药典2000年版培养及菌落计数方法测量其菌落数。 3