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生物化学实验指导 实验一 蛋白质性质实验 【实验目的】 加深对蛋白质胶体分子稳定因素的认识，了解蛋白质的沉淀反应、变性作用的原理及其相互关系。 【实验原理】 1.蛋白质的沉淀反应 蛋白质分子由于形成水化层和双电层而成为稳定的胶体颗粒。但是，蛋白质胶体颗粒的稳定性是有条件的、相对的。在一定的物理化学因素影响下，蛋白质颗粒失去电荷、脱水，甚至变性而丧失稳定因素，即以固态形式从溶液中析出，这种作用称为蛋白质的沉淀反应。该反应可分为以下两种类型： （1）可逆沉淀反应 在发生沉淀反应时，蛋白质虽已沉淀析出，但其分子内部结构并未发生显著变化，基本 上保持原有的性质。沉淀因素除去后，蛋白质沉淀可再溶于原来的溶剂中。这种沉淀反应 为可逆沉淀反应。属于此类反应的有盐析作用；在低温下，乙醇或丙酮对蛋白质的短时间作 用以及等电点沉淀等。 用大量中性盐使蛋白质从溶液中析出的过程称为蛋白质的盐析作用。蛋白质是亲水胶体，在高浓度的中性盐影响下，蛋白质分子被盐脱去水化层，同时，蛋白质分子所带的电荷被中和，蛋白质的胶体稳定性遭到破坏而沉淀析出。沉淀出的蛋白质仍保持其天然蛋白质的性质，若减低盐的浓度时，还能溶解。 （2）不可逆的沉淀反应 在发生沉淀反应时，蛋白质的分子内部结构，空间构象遭到破坏，失去其天然蛋白质的性质，这时蛋白质已发生变性。变性后的蛋白质沉淀不能再溶解于原来的溶液中，这种沉淀反应称为不可逆沉淀反应。重金属盐、生物碱试剂、强酸、强碱、加热、超声波、有机溶剂等都能使蛋白质发生不可逆沉淀反应。 【实验试剂和器材】 （一）试剂1. 鸡蛋清 2. 95%乙醇3. 三氯乙酸 4. 饱和硫酸铵 5．固体硫酸铵 （二）器材试管及试管架，电炉，玻璃漏斗，滤纸，移液管，滴管。【实验步骤】 1．盐析沉淀：取蛋清约2ml于试管中，加入等体积的饱和硫酸铵溶液，搅拌均匀，观察现象。 若有沉淀析出，则为卵球蛋白，静置数分钟，用滤纸过滤，滤出的沉淀物质重新放入蒸馏水中，观察现象。 将滤液放于试管中，再加入固体硫酸铵使达到饱和，观察现象。 2．有机溶剂沉淀：将盐析所得到的蛋白质重新溶于数毫升水中，摇匀使其溶解。向溶液中加入95%乙醇数滴，强力摇匀，观察结果。 3．加热沉淀：将盐析所得到的蛋白质重新溶于数毫升水中，摇匀使其溶解。将试管置于沸水浴中加热并观察现象。 4．变性剂沉淀：将盐析所得到的蛋白质重新溶于数毫升水中，摇匀使其溶解。在试管中滴入数滴三氯乙酸，观察现象。 【实验结果】 列表写出各步骤的实验现象及原因 实验二 考马斯亮蓝G-250法测定蛋白质含量 【实验目的】 蛋白质是细胞中最重要的含氮生物大分子之一，承担着各种生物功能。蛋白质的定量分析是蛋白质构造分析的基础，也是农牧产品品质分析、食品营养价值比较、生化育种、临床诊断等的重要手段。根据蛋白质的理化性质，提出多种蛋白质定量方法。考马斯亮蓝G-250法是比色法与色素法相结合的复合方法，简便快捷，灵敏度高，稳定性好，是一种较好的常用方法。通过本实验学习考马斯亮蓝G-250法测定蛋白质含量的原理，了解分光光度计的结构、原理和在比色法中的应用。 【实验原理】 考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度，是利用蛋白质-染料结合的原理，定量的测定微量蛋白浓度的快速、灵敏的方法。 考马斯亮蓝G-250存在着两种不同的颜色形式，红色和蓝色。考马斯亮蓝G-250在酸性游离状态下呈棕红色，最大光吸收在465nm，当它与蛋白质结合后变为蓝色，最大光吸收在595nm。在一定的蛋白质浓度范围内，蛋白质-染料复合物在波长为595nm处的光吸收与蛋白质含量成正比，通过测定595nm处光吸收的增加量可知与其结合蛋白质的量。 蛋白质和考马斯亮蓝G-250结合，在2min左右的时间内达到平衡，完成反应十分迅速，其结合物在室温下1小时内保持稳定。蛋白质-染料复合物具有很高的消光系数，使得在测定蛋白质浓度时灵敏度很高，可测微克级蛋白质含量。 【实验试剂和器材】 1.仪器 电子天平、试管、试管架、移液管、容量瓶、721型分光光度剂 2.试剂 （1）标准蛋白质溶液：称取10mg牛血清白蛋白，溶于蒸馏水并定容至100mL，制成100μg/mL牛血清白蛋白溶液 （2）考马斯亮蓝G-250蛋白试剂：称取100mg考马斯亮蓝G-250，溶于50mL90%乙醇中，加入85%的磷酸100mL，最后用蒸馏水定容到1000mL。 （3）2g绿豆芽研磨后的提取液定容至50mL 【实验步骤】 1、标准曲线绘制 取6支试管，按下表加入各试剂。 管号 试剂 0 1 2 3 4 5 100μg/mL牛血清白蛋白溶液／mL 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 蒸馏水／mL 1.0 0.8 0.6 0.4 0.