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淀粉酶的活力测定——预习报告 张小雅、罗贵春、蔡晓珍、杨磊、毛政磊（D14生物制药1班第6组） 实验时间： 【实验目的】 (1) 掌握淀粉酶糖化淀粉的原理 (2) 掌握淀粉酶的性质及作用 (3) 熟练淀粉酶活力测定方法 【实验原理】 萌发的种子中存在两种淀粉酶，分别是α-淀粉酶和β-淀粉酶，β-淀粉酶不耐热，在高温下易钝化，而α-淀粉酶不耐酸，在pH3.6下则发生钝化。本实验的设计利用β-淀粉酶不耐热的特性，在高温下（70℃）下处理使得β-淀粉酶钝化而测定α-淀粉酶的酶活性。 酶活性的测定是通过测定一定量的酶在一定时间内催化得到的麦芽糖的量来实现的，淀粉酶水解淀粉生成的麦芽糖，可用3,5-二硝基水杨酸试剂测定，由于麦芽糖能将后者还原生成硝基氨基水杨酸的显色基团，将其颜色的深浅与糖的含量成正比，故可求出麦芽糖的含量。常用单位时间内生成麦芽糖的毫克数表示淀粉酶活性的大小。然后利用同样的原理测得两种淀粉酶的总活性。 【仪器与试剂】 1. 仪器： 离心机、离心管、研体、电炉、容量瓶、恒温水浴锅、20ml具塞刻度试管、试管架、刻度吸管、紫外-可见分光光度计 2. 材料与试剂： 麦芽糖标准液(1Mg／Ml)：称取100Mg麦芽糖，用蒸馏水溶解并定容至100Ml。 DNS试剂(3，5-二硝基水杨酸)：精确称取3，5-二硝基水杨酸1g，溶于20Ml 2Mol／L NAOH溶液中，加入50Ml蒸馏水，再加入30g酒石酸钾钠，待溶解后用蒸馏水定容至100Ml。盖紧瓶塞，勿使CO2进入。若溶液混浊，可过滤后使用。 0.1Mol／L PH5.6的柠檬酸缓冲液：A液(0.1Mol／L柠檬酸)：称取分析纯柠檬酸21.01g，用蒸馏水溶解并定容至1L；B液（0.1Mol／L柠檬酸钠）：称取柠檬酸钠29.41g用蒸馏水溶解并定容至1L；取A液55Ml与B液145Ml混匀，即为0?1Mol／L PH5.6的柠檬酸缓冲液。 1％淀粉溶液：称取1g淀粉溶于100Ml 0.1Mol／L PH5.6的柠檬酸缓冲液中。 材料：萌发的小麦种子（芽长约1~1.5cm) 【操作步骤及说明】 1. 淀粉酶液的制备： 称取1g25℃下萌发3天的小麦种子（芽长约1-1.5cm），置与研钵中，加入少量石英砂和2ml蒸馏水，研磨至匀浆后，将匀浆转入离心管中，用6ml蒸馏水分次将残渣洗入离心管。提取液在室温下放置提取15~20min，每隔2分钟搅动1次，使其充分提取。然后在3000r/min转速下离心10min，将上清液倒入50ml容量瓶中，加蒸馏水定容至刻度，摇匀，既为淀粉酶原液，用于淀粉酶活力的测定。吸取上述淀粉酶原液10ml，放入50ml容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度，摇匀，即为淀粉酶稀释液，用于淀粉酶总活力的测定。 取干燥的种子或浸泡2.5小时后的小麦种子1g，进行淀粉酶的提取，提取方法同上 2.麦芽糖标准曲线制作：取7支干净的具塞刻度试管，编号，按要求加入试剂。加入试剂后摇匀，置沸腾的水浴中煮沸5min。取出后流水冷却，加蒸馏水定容至20ml。以1号管作为空白调零点，在540nm波长下比色测定。以麦芽糖含量为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线。 3酶活力的测定：取6支干净的试管，编号，按要求进行操作，加入试剂后，将各试管摇匀，显色后，在540nm波长处测定光密度（吸光度），记录测定结果，操作同标准曲线。 4.结果计算：用I-2、I-3吸光度平均值与I-1吸光度值之差，在标准曲线上查处相应的麦芽糖含量（mg），再按下式计算α-淀粉酶的活力（Aα），淀粉酶活性以麦芽糖mg/（g·min）表示： Aα=CαVt/FWtV1 Ⅱ-2，Ⅱ-3吸光度平均值与Ⅱ-1吸光度值之差，在标准曲线上查出相应的麦芽糖含量（mg），按下式计算（α+β）-淀粉酶总活力AT： AT=CTVt/FWtV1 式中，A为淀粉酶活性，Aα为α-淀粉酶的活力，AT为淀粉酶总活性，主要是α、β淀粉酶的活性；Cα为α-淀粉酶水解淀粉生成的麦芽糖量（查标准曲线求值，以下同）；CT为（α+β）淀粉酶共同水解淀粉生成的麦芽糖量；V1为显色所用酶液体积（ml）；t为酶作用时间（min）；Vt为样液稀液总体积（α-淀粉酶为50ml，α+β淀粉酶为500ml）；FW为样品鲜重（g）。 【预期结果与分析】 1. 将测得的吸光度填入上表中，并根据数值作出标准曲线。 2. 计算公式：淀粉酶活力=C×VT/(W×Vs×T)(mg/g/min) ①浸提步骤。70℃温度或15min时间控制不严格不准确则可能导致β淀粉酶未完全钝化使测得活性偏大。应严格控制温度和时间。 ②70℃水浴后需要立即冰浴，否则β淀粉酶复性使测得α淀粉酶活性结果偏大。 【注意事项】 1.样品提取液的定容体积和酶液稀释倍数可根据不同材料酶活性