纖维素霉的固态培养及酶活力的测定(学生实验指导).docVIP

专业实验： 纤维素酶的固态发酵及酶活力的测定 一、实验目的： 1.学习固态发酵生产纤维素酶的方法； 2.掌握纤维素酶测定的方法； 3.了解不同条件对纤维素酶活力的影响。 二、实验原理 纤维素是地球上含量最丰富的有机化合物。据不完全统计，全球每年通过光合作用产生的纤维素最高达1. 7 亿t。其中大部分尚未被合理利用。目前，我国约有一半以上的农作物秸秆在田间地头被白白烧掉。可见，利用纤维素酶水解农作物秸秆等废弃物，使其转化为酒精、粮食和化学制品，具有巨大的经济价值和现实意义。纤维素酶能将天然纤维素降解，生成纤维素分子链、纤维二糖和葡萄糖，然而目前制约纤维素材料转化为乙醇并实现产业化的关键因素之一是纤维素酶效率低下，另一方面，纤维素酶多是采用纯的纤维素粉、无机盐等配制而成的培养基进行液态发酵，对培养基要求高，酶系不全且易造成环境污染等问题，在实际进行大规模生产纤维素酶中还有较多困难。利用廉价的原料，采用固态发酵技术，可望有助于进一步降低纤维素酶的生产成本。 三、实验材料和仪器 1、材料： 麸皮（麸皮粉碎，过1 mm筛）；滤纸；产纤维素霉菌种；酒精（95％）；浓硫酸；蛋白胨；羧甲基纤维素钠；NH4NO3；酵母膏；刚果红；3，5-二硝基水杨酸，乙酸等。 （1）菌种保藏培养基，PDA琼脂。 （2）种子培养基，麸皮2％，(NH4)2SO4 0.2％，蛋白胨0.1％，KH2PO 0.1％ ，CaCO30.1%，自然pH，50 mL三角瓶装培养基5 mL，121℃ 灭菌，30 m in。 （3）发酵培养基:纤维素材料90％，麸皮10％，(NH4)2SO4 2.5％，蛋白胨0.5％，水250 mL，250 mL三角瓶装干料10g，121℃灭菌20 min。 （4）0.1M乙酸－乙酸钠缓冲溶液（pH=4.8） 溶液A：量取冰醋酸6mL，定容至1000ml，制成0.1M醋酸溶液。 溶液B：称取8.2g醋酸钠，溶解后容至1000mL，制成0.1M醋酸钠溶液。 使用时以A：B=4：6的比例混合，低温冷藏备用。 DNS显色剂 称取酒石酸钾钠182.0g，溶于500mL蒸馏水中，加热（不超过50℃），于热溶液中依次加入3，5-二硝基水杨酸6.3g，NaOH 21.0g，加热搅拌，使之溶解，再加入苯酚5.0g，无水亚硫酸钠5.0g，搅拌至溶解完全，冷却后用蒸馏水定容至1000mL。贮存于棕色瓶中，暗处放置一星期后过滤使用。 CMC（1%） 准确称取1.000g羧甲基纤维素钠，用pH4.8醋酸缓冲液溶解并定容至100mL。 葡萄糖标准溶液（1.0mg/mL）：称取1.000g葡萄糖（AR）(105℃干燥至恒重)用蒸馏水溶解后定容至1000mL，冰箱保存备用。 滤纸条：1cm×6cm 新华滤纸。 2、仪器：生化培养箱；水浴锅；天平；分光光度计；接种环；试管；三角瓶；比色管。 四、实验方法和步骤 1、斜面培养 纤维素酶生产菌种接入斜面培养基中，在一定30℃下培养5～6d，观察和记录纤维素酶生产菌生长的典型现象。 斜面孢子液的制备 吸取5mL蒸馏水于斜面试管中，接种环刮洗孢子，计数。 锥形瓶固态发酵 接种5mL孢子悬浮液（107～108个/mL）于装有固体产酶培养基中，置于生化培养箱中，以待测的温度和时间进行培养。考察不同因素对酶活的影响。发酵结束后置于45℃烘箱中干燥过夜。 4、酶活力的测定 （1）粗酶液的制备 称取1g干燥固态发酵曲，加入10倍的0.1mol/L pH4.8的乙酸缓冲液，室温下浸泡4h，于4000r/min离心15min，取上清液测定酶活。 （2）酶活的测定 ①标准曲线的绘制（根据实际测定的酶液吸光值，对应该曲线可以查出相应的酶活力） 分别吸取1mg/mL标准葡萄溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0mL，分别定容至50mL。 再分别吸取上述溶液各1.5mL于比色管中，各加1.5mL3,5一二硝基水杨酸溶液，煮沸5min（另作1管对照，取1.5mL蒸馏水，加1.5mL3,5一二硝基水杨酸溶液，同样煮沸5min。 冷却后，用分光光度计在540nm波长下比色，以光密度做纵坐标，对应标准葡萄糖溶液含糖的毫摩尔数（酶活力）为横坐标，绘制标准曲线。 ②羧甲基纤维素酶活（CMCase）测定 取1mL酶液（稀释10倍）（另取1mL酶液在沸水浴中煮20min灭活对照），加入1mL pH=4.8的1%CMC-Na溶液，置于50℃中恒温反应30min，然后加入1mL DNS，在沸水浴中显色5min，冷却，定容至25mL，摇匀，测540nm吸光度（以灭活的的酶液经同样操作后作为对照）。 ③ 滤纸酶活的测定 取1mL 酶液（稀释10倍）加1mL0.1mol/L pH4.8的醋酸缓冲液，预热到50℃，加入1条 1cm×