03-蛋白质-6报告.ppt

测分子量的方法： 化学组成法测定最低分子量 SDS法 凝胶过滤法 渗透压法 扩散系数法 沉降系数法和沉降平衡法 1. 根据分子组成测定最小分子量 p291 如肌红蛋白含0.335%的铁 Fe分子量 55.8 最小M＝ Fe(%) = 0.335 =16700 (实为16900马心) 牛血清白蛋白含Trp0.58% 最低M=35200，实际为69000，含2个Trp 3 .据pr的渗透压 p292 用一半透膜将pr溶液与纯水隔开，当渗透达平衡时，测定其渗透压，计算分子量： 4.SDS—PAGE p298 （十二烷基硫酸钠—— 聚丙烯酰胺凝胶电泳） 1、等电点沉淀 P305 在等电点条件下，蛋白质的电导性、溶解度最小，粘度最大 在pI时，分子电荷为零，蛋白质分子间的静电排斥消失，从而蛋白质出现聚集沉淀 2、蛋白质的盐溶与盐析 P305 盐溶：低盐浓度时，蛋白质溶解度↑，称盐溶。 盐析：高盐浓度时，使pr溶解度↓析出，称盐析。 盐析多用溶解度大的中性盐，如(NH4)2SO4、NaCl、MgCl2、NH4Cl、KCl等的饱和溶液 1、电泳和等电聚焦法： 普通电泳、等电聚焦、双向电泳、脉冲电泳、毛细管电泳 从电泳结果分：自由界面电泳、区带电泳、盘状电泳 从装置上分：圆盘电泳（柱状）、水平板电泳、垂直板电泳。 从支持物分：自由界面电泳、纸电泳（或薄膜电泳）、凝胶电泳（PAGE ，琼脂糖胶，淀粉胶等） 极 性：硅胶、氧化铝、岩藻土（离子吸引和氢键） 最广泛最有效：羟基磷灰石（hydroxyapatite)，即结晶磷酸钙[Ca10（PO4）6（OH）2]，可分离蛋白质、核酸，与DNA的亲和力最高。 非极性：苯基琼脂糖、辛基琼脂糖（范德华力、疏水作用） 根据疏水性的差异：疏水层析和反相HPLC 亲和层析(affinity chromatography)：是利用蛋白质分子对其配体分子特有的识别能力，也即生物学亲和力，建立起来的一种有效的纯化方法。 免疫亲和层析 凝集素亲和层析 金属螯和层析 染料配体层析 等电聚焦电泳法可测定蛋白质pI 2D gel in proteomics 2、离子交换层析法：P310 离子交换纤维素： 离子交换交联葡聚糖：兼有分子筛效应 离子交换交联琼脂糖： 交联葡聚糖离子交换剂 P310 表7-6 阴离子 阳离子 （四）根据选择性吸附的差异：吸附层析法 （五） 配体亲和力的差异 ： 亲和层析 亲和层析 七、蛋白制品的含量分析、纯度鉴定 与活性分析 p315 （一）、含量分析 总蛋白含量分析：凯氏定氮法、Folin-酚法（Lowry法）、双缩脲法、考马斯亮蓝法、紫外吸收法 特定蛋白组分的含量分析： 酶和激素等：酶活性或激素活性表示（比活性） 其它蛋白：抗原抗体反应(western blot) （二）纯度鉴定（均一性） 基本手段：电泳分析：单条带。 N端测定：n亚基蛋白有1-n个N端aa。 选用手段：沉降分析、溶解度分析、 结晶分析（能结晶的一般比较纯，具有活性） 七、蛋白制品的含量分析、纯度鉴定 与活性分析 p315 （三）活性分析 * 第三章 蛋白质 Proteins 生物化学 一、蛋白质的酸碱性质 二、蛋白质的分子大小与形状 三、蛋白质的胶体性质与蛋白质的沉淀 四、蛋白质分离纯的一般原则 五、蛋白质混合物的分离方法 六、蛋白质含量的测定与纯度鉴定 第六节 蛋白质的分离纯化 p290 蛋白质与氨基酸相似，也具有两性电离的性质。蛋白质的多肽链含有末端氨基和羧基，一些侧链上含有可解离的基团，有的可以接受氢离子，有的可以电离出氢离子，因此蛋白质具有酸碱两性电离的性质。它的两性电离比氨基酸复杂。 对某一蛋白质而言，在某一pH下，当它所带正负电荷相等的时候，该溶液的pH就称为该蛋白质的等电点。 蛋白质的等电点的大小与蛋白质的氨基酸组成有关。 一、蛋白质的两性电离和等电点 蛋白质溶液有许多高分子溶液的性质，如：扩散慢、易沉降、 粘度大、不能透过半透膜，在水溶液中可形成亲水的胶体，具有丁达尔现象。 ?蛋白质胶体溶液的稳定因素：水化膜、带电荷。当破坏这两个因素时，蛋白质中从溶液中析出而产生沉淀。 二、蛋白质的高分子性质 ?使蛋白质从溶液中析出的现象称为沉淀，方法有： 1. 盐析：在蛋白质的水溶液中，加入大量高浓度的强电解质盐如硫酸胺、氯化钠、硫酸钠等，使蛋白质从溶液中析出，称