Tan第五章目的基因的導入和重组子的筛选.ppt

欢迎同学们听课！ 欢迎研究生听课！ 本课程内容 第一章 绪论 第二章 基因克隆的工具酶 第三章 基因工程的载体 第四章 目的基因的制备 第五章 目的基因导入和重组子的筛选 第六章 外源基因的表达 第七章 基因操作的基本技术 第八章 植物基因工程及应用 第九章 动物基因工程及应用 第十章 医学基因工程及应用 第五章 目的基因导入和重组子的筛选 5.1 DNA片段的连接重组 5.2 受体细胞选择的基本原则 5.3 基因转移 5.4 重组子的筛选 5.1 DNA片段的连接重组 5.1.1 DNA连接类型 5.1.2 DNA片段之间连接的方式 5.1.3 DNA重组中需注意的问题 DNA分子连接 不同的DNA片段（目的基因和载体）经适当酶切后，在连接酶的作用下，连接在一起构建成重组DNA分子 。 5.1.1 DNA重组（连接）的类型 插入重组: 载体上只有唯一的酶识别位点 随机（非定向）插入 置换重组 (1) 载体上有两个同样的酶识别位点 随机（非定向）置换 (2) 载体上有两个不同的酶识别位点 定向置换 5.1.2 DNA片段之间连接的方式 具互补黏性末端片段之间的连接 具平末端DNA片段之间的连接 DNA片段末端修饰后进行的连接 DNA片段加linker or adaptor后的连接 5.1.3 DNA重组中需注意的问题 5.2 受体细胞及其选择的基本原则 5.2.1 受体细胞 5.2.2 受体细胞选择的基本原则 5.2.1 受体细胞 受体细胞（receptor cell）：又称为宿主细胞或寄主细胞（host cell） 从实验技术上讲：是能摄取外源DNA并使其稳定维持的细胞。 从实验目的上讲：是有应用价值和理论研究价值的细胞。 5.2.2 受体细胞选择的原则 外源DNA分子能稳定存在，限制酶缺陷型； 重组基因缺陷型； 易于转化/ 转导； 易筛选 遗传稳定性高，易于扩大培养； 安全性高； 内源蛋白酶基因缺失或缺陷； 遗传密码无明显偏好性； 具有较好的转译加工机制； 较高的理论和实践应用价值。 5.3 基因转移（gene transfer） 载体与目的基因连接后，体系中可能存在下列分子：　　　a. 未连接的载体分子　　　b. 未连接的DNA片段　　　c. 载体的自连　　　d. 含有错误插入片段的重组DNA分子　　　e. 重组DNA分子　　转化过程中，这些分子同时被转移到宿主细胞内。未连接的分子即使被细菌摄取，只有在特殊的条件下才能复制，寄主的酶可降解这些DNA片段。自连的载体和错误插入的重组质粒可以进入 宿主细胞进行正常的复制。因此，需要将重组克隆鉴定出来。 把重组DNA导入受体细胞进行扩增 根据所用载体的特性选择适宜的受体细胞及选择适宜的重组DNA导入的方式：转化、转染和转导。 5.3 基因转移（gene transfer） 5.3.1 重组质粒DNA分子转化大肠杆菌 5.3.2 重组?噬菌体DNA分子转导大肠杆菌 5.3.3 重组DNA分子转入真核细胞 5.3.1 重组质粒DNA分子转化大肠杆菌 5.3.1.1 细菌转化的机制 5.3.1.2 化学转化法（CaCl2诱导大肠杆菌转化法） 5.3.1.3 电激法（电穿孔转化法） 5.3.1.4 转化率的计算及其影响因素 5.3.1.1 细菌转化的机制 转化(transformation)： 重组质粒DNA分子通过与膜蛋白结合进入受体细胞，并在受体细胞内稳定维持和表达的过程称为转化。　　自然界中，转化并不是细菌或的遗传信息的主要方式，实验室中只有小部分的细菌可以很容易的转化，进一步的研究发现，这类细菌含有DNA结合和吸收的代谢机制。正常条件下，大部分细菌包括大肠杆菌，只能吸收有限的DNA，为了提高转化效率，建立了一系列的转化方法： 　　　a. 热激法转化感受态细胞 　　b. PEG介导的原生质体转化 　　c. 高压电穿孔法转化 d. 显微注射法转化 　e. 接合转化 　f. 噬菌体转染 5.3.1.2 化学转化法（CaCl2诱导大肠杆菌转化法） 5.3.1.2 化学转化法（CaCl2诱导大肠杆菌转化法） 感受态细胞制备： 感受态细胞：指处于能吸收周围环境中DNA分子的生理状态的细胞。 菌种活化、培养、收菌和进行CaCl2处理。 DNA分子转化感受态细胞： 冰浴、42oC热激、37 oC恢复、涂板培养。 5.3.1.3 电激法（电穿孔转化法） 原理：利用高压电脉冲作用，在细菌细胞膜上进行电穿孔 （electro