第八章熒光免疫技术.ppt

第八章 荧光免疫技术 第一节 概述 　一、荧光的基本知识 　二、荧光物质 第二节 荧光抗体技术 　一、标本的制作 　二、荧光抗体的制备 　三、荧光抗体染色与结果判断 　四、荧光显微镜的基本结构 第三节 荧光免疫分析的类型 　一、时间分辨荧光免疫测定 　二、荧光偏振免疫测定 　三、荧光酶免疫测定 1．荧光、荧光效率、荧光寿命和荧光淬灭的概念是什么？ 2．常用的荧光物质有哪些？ 3．荧光免疫技术有哪些类型？ 4．荧光抗体技术的基本原理是什么？ 3．什么是荧光抗体？如何制备、纯化和鉴定荧光抗体？ 4．荧光抗体染色有哪些方法？各自的反应原理是什么？ 5．荧光免疫测定的基本原理是什么？有哪些方法类型? 6．时间分辨荧光免疫测定的原理是什么？有哪些方法类型? 7．荧光偏振免疫测定的原理是什么？ 8．荧光酶免疫测定的原理是什么？有哪些方法类型? 9．如何评价各种类型的荧光免疫测定？ 10．荧光免疫测定有何应用？ 荧光免疫技术是将抗原抗体反应的特异性与荧光技术的敏感性相结合，对抗原或抗体进行定性、定位或定量检测，包括荧光抗体技术和荧光免疫测定。 荧光抗体技术是以荧光素标记抗体,与抗原反应, 在荧光显微镜下观察呈现特异荧光的抗原抗体复合物，进行定性和定位检测, 分为直接法、间接法和双标记法等。 荧光免疫测定是将抗原抗体反应与荧光物质发光分析相结合，检测抗原抗体复合物中特异性荧光强度，进行定量测定，分为均相和非均相。 时间分辨荧光免疫测定： 蛋白质、激素、药物、肿瘤标记物、病原体抗原/抗体等 荧光偏振免疫测定： 药物、维生素、激素、常规生化项目等 荧光酶免疫测定： 病毒抗体、细菌和毒素抗原、激素、肿瘤标志物等 二、荧光免疫测定的应用 思考题 思考题 透射光：照明光线从标本下经聚光器透过标本进入物镜。 落射光：照明光线从标本上经垂直照明器落射到标本，经标本反射进入物镜。 透射荧光显微镜光路(a) 落射荧光显微镜光路(b) 荧光显微镜 光路 荧光显微镜的基本结构 第三节 荧光免疫分析的类型 荧光免疫分析的基本原理 将抗原抗体反应与荧光物质发光分析相结合，用荧光检测仪检测抗原抗体复合物中特异性荧光强度，对液体标本中微量或超微量物质进行定量测定。 荧光抗体技术 荧光免疫测定 均相荧光免疫测定 （homogeneous fluorescence immunoassay） 非均相荧光免疫测定 （heterogeneous fluorescence immunoassay） 荧光免疫技术 荧光免疫技术是将抗原抗体反应的特异性与荧光技术的敏 感性相结合，对抗原或抗体进行定性、定位或定量检测。 荧光免疫技术的类型 荧光免疫测定的方法类型 非均相荧光免疫测定： 时间分辨荧光免疫测定、荧光酶免疫测定 均相荧光免疫测定： 荧光偏振免疫测定 自发荧光寿命短:1ns～10ns 镧系元素寿命长:10μs～1000μs 短寿命荧光完全衰变后再测定镧系 元素特异荧光 基本原理 时间分辨检测原理示意图 时间分辨 一、时间分辨荧光免疫测定 stokes位移:激发光谱和发射光谱的波长差 镧系元素Stokes位移大(273nm)，激发光谱 和发射光谱不重叠 stokes位移 基本原理 时间分辨荧光免疫测定 发射光谱带较窄：613nm±10nm，干扰少 激发光谱带较宽：300nm～350nm，灵敏度高 基本原理 发射光谱和激发光谱 时间分辨荧光免疫测定 比活性：单位时间每个标记分子被探测的信号量 荧光激发光源1000次/S激发，比活性提高 基本原理 荧光标记物的相对比活性 时间分辨荧光免疫测定 结合β-二酮体 Eu3+解离 酸性增强液 荧光增强 Eu3+标记抗原抗体复合物 基本原理 信号增强 时间分辨荧光免疫测定 镧系元素 铕(Eu3+)（最常用） 钐(Sm3+) 铽(Tb3+) 钕(Nd3+) 镝(Dy3+) 标记物 1000 Dy3+-PTA 14 丹黄酰氯 714000 Eu3+-β-NTA 3.0 球蛋白 3.0 罗丹明B 96000 Tb3+-PTA 4.5 FITC 925000 Eu3+-PTA 3.5 细胞色素C 60000 Sm3+-PTA 4.1 人血清蛋白 65000 Sm3+ -β-NTA 1～10 非特异荧光背景 荧光寿命(ns) 荧光物质 荧光寿命(ns) 荧光物质 常见荧光物质的荧光寿命 时间分辨荧光免疫测定 标记方法 双功能螯合剂： 1-（对-苯偶氮）-EDTA 异硫氰酸苯基-EDTA 异硫氰酸苯甲基-DTTA 二乙烯三胺五乙酸（DTPA） 标记方法： 一步法：先螯合Eu3+，再连接蛋白质 二步法：先连接蛋白质，再螯合Eu3+ 时间分辨荧光免疫测定 方法