-免疫细胞的分离与检测.ppt

* 用斑蝥敷贴法可从人体组织液中获取较纯的巨噬细胞，不需作进一步体外分离，细胞量损失较少。该法是用滤纸蘸取10％中药斑蝥酒精浸出液，贴敷在臂内侧皮肤表面，4～5h后皮肤局部充血，48h后局部形成水疱，吸取疱中的组织液，内含巨噬细胞。但此法对病人皮肤有一定损伤，有时可引起局部感染，应慎用。 * 右旋糖酐加速红细胞沉降 ＋ B cell B cell EAC花环形成试验 补体受体 小鼠红细胞受体： 慢性B细胞白血病 方法简单，鉴定类型 第三节 淋巴细胞功能检测 T细胞功能检测 B细胞功能检测 NK细胞活性测定 一、T细胞功能检测 Produce cytokines 产生细胞因子 Cytotoxic action 细胞毒活性 Mediate DTH 参与过敏反应 T细胞的功能 T细胞功能检测试验 T细胞增殖试验 CTL介导的细胞毒试验 T细胞分泌功能检测 检测T细胞功能的体内试验 T细胞增殖试验 形态学法 3H-TdR掺入法 MTT比色法 CFSE标记染色法 形态学法 PBMC PHA/ConA 5％CO2 、 37℃培养72h 细胞涂片染色 显微镜检查 未转化淋巴细胞 转化的淋巴母细胞 转化率（％） ＝ 转化的淋巴细胞数 计数的淋巴细胞总数 X100％ Sitmulated by mitogen or antigen 48h 3H-TdR Count CPM 3H-TdR掺入法 CFSE的前体（CFDSE）可进入细胞，降解后形成CFSE，在一定波长的光激发下可发出荧光。当细胞分裂时，CFSE平均分配到子细胞中，使荧光量减半，再采用流式细胞仪分析细胞增殖活性。 CFSE标记染色法 T cell proliferation analyzed by CFSE labeling T细胞介导的细胞毒试验 CTL杀伤靶细胞的机制 通过颗粒酶和穿孔素杀伤靶细胞 通过Fas－FasL介导细胞凋亡 CTL介导细胞毒作用的检测方法 形态学检查法 51Cr释放法 细胞凋亡检测法 （1）形态学检测法 （2）DNA Ladder （3）ELISA （4）Flow cytomery Cytotoxicity Assays (51Cr release) B细胞增殖试验 溶血空斑试验 ELISPOT检测抗体分泌细胞 抗体的检测 B细胞功能检测 Direct assay for IgM-secreting plasma cells (primary response) Indirect assay for IgG-secreting plasma cells (secondary response) ELISPOT检测抗体形成细胞 第四节 吞噬细胞功能测定 中性粒细胞 巨噬细胞 趋化功能检测 吞噬和杀菌功能测定 中性粒细胞功能检测 中性粒细胞趋化功能检测 －－琼脂糖平板法 中性粒细胞趋化功能检测－－Boden 小室法 Boyden Chamber Shi et al. J Immunol Methods, 1993, 164: 149 中性粒细胞吞噬功能测定 中性粒细胞 白色葡萄球菌 显微镜观察 中性粒细胞吞噬功能测定 巨噬细胞功能检测 碳粒廓清实验 吞噬功能检测 巨噬细胞溶酶体酶的测定 细胞毒作用测定 巨噬细胞促凝血活性测定 巨噬细胞产生细胞因子的检测 巨噬细胞 鸡红细胞 白色念珠菌 酵母细胞 ＋ 孵育 涂片 染色 镜检 计算吞噬率和吞噬指数 巨噬细胞吞噬功能检测 巨噬细胞产生细胞因子的检测 中国生化药物杂志，2002，23（2）：67 -69 小 结 Ficoll-Hypaque PBMC T细胞 尼龙棉柱分离 FCAS 免疫磁珠分选 B细胞 外周血 1. 淋巴细胞的分离 小 结 2. 吞噬细胞的分离 3. 淋巴细胞计数 E花环试验 EA花环试验 EAC花环试验 流式细胞仪计数 小 结 4. 淋巴细胞功能测定 T淋巴细胞增殖试验 CTL介导的细胞毒作用 溶血空斑试验 ELISPOT检测抗体分泌细胞 5. 吞噬细胞功能检测 Thanks * 班蝥：banmao 间接法 单克隆抗体CD3 羊抗鼠修饰磁球 Biomag T细胞 T细胞 免疫磁珠法细胞分选过程 免 疫 磁 珠 细 胞 分 选 装 置 特点: 简便, 快速, 费用低, 无需特殊设备 全自动细胞分选仪 MACS法（magnetic activated cell stoter） S N 阴性选择 （负选法）