第九章酶免疫技術.ppt

第九章 酶免疫技术 第一节　酶免疫技术的特点 　一、酶和酶作用底物 　二、酶标记抗体或抗原 　三、固相载体 第二节酶免疫技术的分类 一、均相酶免疫测定 二、非均相酶免疫测定 第三节　酶联免疫吸附试验 一、基本原理 二、方法类型及反应原理 第一节 酶免疫技术的特点 主要试剂: 酶标记的抗体或抗原 酶标物特点： 免疫学活性 酶对底物的催化活性 第二节　酶免疫技术分类 EMIT示意图 CEDIA示意图 分类：液相酶免疫测定 固相酶免疫测定 以聚苯乙烯等材料作为固相载体的酶联免疫吸附试验（ELISA） 是目前最为常用的固相酶免疫测定 第三节　酶联免疫吸附试验 　 竞争法 方法：用已知抗体包被，加入待测血清，再加酶标抗原，酶标抗原与待检物竞争与包被物结合。加底物显色。 应用：用于只有一个抗原决定簇的小分子半抗原（药物、激素等） 竞争法 原理：类似检测抗原的竞争法 应用：乙型肝炎病毒核心抗体(HBcAb)和乙型肝炎病毒e抗体(HBeAb)的检测 捕获法 均相酶免疫测定主要用于药物和小分子物质的检测。非均相免疫测定中的ELISA应用更为广泛，ELISA广泛用于传染病的诊断，病毒如病毒性肝炎（甲肝抗体、“乙肝三对”、丙肝抗体、丁肝抗体、戊肝抗体）、风疹病毒、疱疹病毒、轮状病毒等；细菌如结核杆菌、幽门螺杆菌等。也用于一些蛋白质检测，如各种免疫球蛋白、补体、肿瘤标志物（甲胎蛋白、癌胚抗原、前列腺特异性抗原等）。 1．酶免疫技术的要点？ 2．酶联免疫吸附试验的原理（ELISA）？ 3．竞争法在酶联免疫检测应用中的原理和应用？ 4．常用的底物有哪几类？特点？ 5．常用的酶有哪几类？特点？ 6．何谓包被与封闭？其作用？ 7．常用固相载体的种类和特点？ 8．举例固相酶免疫测定应用的原理及影响因素。 9．ELISA的非特异性干扰有哪些，其机制？ 10．对酶免疫技术的应用评价如何？ 酶免疫技术是标记免疫技术的一种，它是以酶标记的抗原或抗体作为主要试剂的免疫检测方法，在抗原与抗体的特异性反应完成后，通过酶对底物的作用进一步提高敏感性。酶免疫技术可分为酶免疫组织化学技术和酶免疫测定两大类,后者根据抗原抗体反应后是否需要分离结合与游离的酶标记物而分为均相和非均相两种类型。 均相酶免疫测定主要用于小分子激素和半抗原的测定，非均相酶免疫测定根据是否使用固相支持物，又可分为液相和固相酶免疫测定两种类型。最常用的是以聚苯乙烯等材料作为固相载体的酶联免疫吸附试验（ELISA）,其原理可以有夹心法、竞争法、间接法和捕获法等。 固相的抗原或抗体 酶标记物（酶结合物） 酶反应的底物 三个必要试剂 二、方法类型及反应原理 双抗体夹心法 方法：用已知抗体包被，加入待检血清，再加酶标抗体，加底物显色 应用： 二价或二价以上的较大分子抗原测定 乙型肝炎表面抗原、甲胎蛋白、HCG等 ELISA检测抗原的方法 双抗体夹心法测抗原 + - E E E E E E E E E ELISA检测抗原的方法 竞争法测抗原 + - E E E E E E E 2、加待检物 抗原与酶标抗 原竞争与抗体 结合 3、加酶作用 的底物不显色 或显色弱 3、加酶作用 的底物显色 1、已知抗体包 被于载体表面 1、已知抗体包 被于载体表面 2、加待测物 和酶标抗原， 酶标抗原与抗 体结合 E 间接法 方法 用已知抗原包被，加入待测血清，再加酶标的抗人IgG（抗抗体或二抗）加底物显色。 优点 一种酶标抗抗体检测各种与抗原相应的抗体 应用 常用于HCV抗体、HIV抗体和梅毒螺旋体抗体等的测定 ELISA检测抗体的方法 间接法测抗体 - E E E E E E E E E + 双抗原夹心法 原理：类似双抗体夹心法 操作步骤：类似 应用：乙型肝炎表面抗体 ELISA检测抗体的方法 ELISA检测抗体的方法 捕获法 应用： 病原体急性感染诊断中的IgM型抗体 甲型肝炎HAV-IgM抗体 乙型肝炎病毒核心HBc-IgM抗体 ELISA检测抗体的方法 原理： 抗人IgMμ链抗体包被 捕获待测标本中IgM类抗体 加入特异性抗原和酶标记特异性抗原的抗体 底物显色 捕获法原理 + - E E E E E 1、固相化抗人 　IgM 1、固相化抗人 　IgM 2、加待测物 特异性IgM与 非特异性IgM 和抗人IgM结合 3、加特异性 抗原，与特异 性抗体结合 4、加酶标抗体 与特异性抗原结 合，加底物显色 2