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第一节 DNA克隆 一、基因克隆（分子克隆molecular cloning） 通过体外重组技术,将一段目的DNA经切割、连接插入适当载体，并导入受体细胞，扩增形成大量子代分子的过程。 二、基因克隆的核心---体外重组(Recombination) 人工将一段目的DNA插入一个载体的过程。 （一）目的DNA片段的获得 从mRNA合成cDNA：逆转录酶 PCR 人工合成 从基因文库中筛选： 基因组文库、 cDNA 文库 PCR技术的发明 1983年, Mullis发明了PCR技术 1988年Saiki等将耐热DNA聚合酶（Taq）引入了PCR技术 Mullis荣获1993年度诺贝尔化学奖。 原理 在微量离心管中, 加入适量的缓冲液, 微量的模板DNA,四种脱氧单核苷酸，耐热的多聚酶, 一对合成DNA的引物, 通过高温变性、低温退火和中温延伸三个阶段为一个循环, 每一次循环使特异区段的基因拷贝数放大一倍, 一般样品是经过30次循环, 最终使基因放大了数百万倍 。 PCR产物是介于引物的5’端之间的双链DNA片段。 1、反应体系： 模板（template） 引物（primers） Taq DNA 聚合酶 dNTP 反应缓冲液（Mg2+） 2、反应影响因素： G+C 含量 退火温度：Tm=2（A+T）+4（G+C） Mg2+浓度 第一步 加热变性 第二步 退火 第三步 延伸 第1个 PCR 循环完成后得到两个拷贝的靶序列 4、Taq DNA聚合酶 离子需要：对Mg2+、单价离子性质和浓度较 敏感。最适浓度为50mmol/L。 忠实性:没有校正单核苷酸错配功能--致命弱点。一般出错率为2×10-4核苷酸/每轮循环，利用PCR克隆、测序时尤应注意。 引物是PCR特异性反应的关键，PCR 产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度 5、引物的设计 18-30 nt 3’端不能形成发夹结构 G+C 含量（? 50%）:ATGC随机分布 两引物无互补序列 3’端的几个核苷酸与模板DNA一定要配对 注：引物3’端决定引物的特异性 PCR和细胞内DNA复制的相同点： （1）两者都符合半保留复制模型，即两条链都可作为 模板，子代链中一条链来自于亲代链，另一条链 是新合成的 （2）两者都需要引物 （3）两者都需要依赖DNA的DNA聚合酶 （4）两者的底物都是dNTP （5）DNA合成时都是在DNA聚合酶作用下按碱基配对 原则往3’-OH上加dNTP，形成3’，5’磷酸二酯键 （6）两者新合成链延伸的方向都是5’to3’ （7）两者DNA合成的保真度（精确性）都较高 PCR和细胞内DNA复制的不同点： （1）复制为半不连续复制，而PCR两条链的合成都是连续的 （2）复制时引物是由引发酶或引发体合成的，而PCR引物是在反应前加到反应体系中 （3）复制需要在特定的复制原点起始，并且有终止点，而PCR在有特异引物存在时在任何序列都可起始，并且没有终止点 （4）复制时两条模板链是在解旋酶的作用下局部打开双链，而PCR两条模板链通过变性完全打开双链 （5）复制时两条链的合成是同步进行的，而PCR两条链的合成可能不同步 （6）PCR的DNA聚合酶为耐热的DNA聚合酶，而复制的聚合酶一般不耐热 （7）复制一般为双向复制，而PCR反应中DNA合成是单向的 （8）复制时由多种蛋白因子参与，而PCR只有DNA聚合酶参与 （一）逆转录PCR（Reverse transcription－PCR, RT-PCR）RNA经逆转录后可作为模板进行PCR. RT－PCR常用于基因表达研究（定量PCR） （二）多重PCR（Multiple PCR）在同一PCR反应体系中用多对引物（覆盖不同长度的靶序列）同时扩增。 (三) 套式PCR（nested PCR）用第一次PCR扩增区域内部的第二对（套式）引物对第一次PCR产物再次扩增,可以增加特异性和灵敏度。 (四) 非对称PCR（asymmetric PCR） 目的：扩增产生特异长度的单链DNA 方法：采用两种不同浓度的引物。分别称为限制性引物和非限制性引物, 其最佳比例一般是0.01∶0.5μM, 关键是限制性引物的绝对量。 用途：制备核酸序列测定的模板 制备杂交探针 (五) 反向PCR(reverse PCR) 是用反向的互补引