分子生物学研究方法上.ppt

？现代分子生物学的快速发展 分子生物学研究方法，特别是基因操作技术和基因工程技术的进步。 核酸操作技术主要包括：核酸凝胶电泳、核酸的提取与纯化、 PCR扩增、突变位点的检测、 DNA分子的切割与连接、细胞转化、核酸序列分析、核酸分子杂交以及基因的人工合成、定点突变等。 一、核酸分离原则 （一）保持核酸分子一级结构的完整性 温度不要过高； 控制一定的pH值范围(pH值5-9); 保持一定的离子强度; 减少物理因素对核酸降解的机械剪切力。 一、核酸分离原则 （二）防止核酸的生物降解 细胞内或外来的各种核酸酶能消化核酸链中的磷酸二酯键，破坏核酸一级结构。所用器械和一些试剂需高温灭菌，提取缓冲液中需加核酸酶抑制剂。 1 DNA酶抑制剂 金属离子螯合剂：DNA酶需要金属二价离子Mg2+、Ca2+的激活，使用其螯合剂可抑制DNA酶活性。如EDTA-Na2； 阴离子型表面活性剂：如SDS对核酸酶有抑制作用，还能使蛋白质变性，并与变性蛋白结合成带负电荷的复合物，该复合物高盐溶液中沉淀。 一、核酸分离原则 （二）防止核酸的生物降解 2、RNA酶（RNAase) RNAase分布广泛，极易污染样品，且耐高温、耐酸、耐碱，不宜失活。 DEPC(二乙基焦碳酸盐) (C2H5OCOOCOOC2H5) 粘性液体，很强的核酸酶抑制剂。 作用机制：与蛋白质中His结合使蛋白变性。 使用注意：剧毒；DEPC也能破坏单链核酸中大部分腺嘌呤环。但浓度比使蛋白质变性的浓度大100～1000倍；容易降解，保存在4 ℃或液氮中；提RNA时，0.1% DEPC浸泡器皿37℃ 2 h。 一、核酸分离原则 2、RNA酶（RNAase) 1) 所有的玻璃器皿-使用前180℃的高温下干烤6h或更长时间。 2) 塑料器皿用0.1% DEPC水浸泡或用氯仿冲洗（注意：有机玻璃器具因可被氯仿腐蚀，故不能使用） 3) 有机玻璃电泳槽等，先用去污剂洗涤，双蒸水冲洗，乙醇干燥，再浸泡在3% H2O2室温10min，然后用0.1% DEPC水冲洗，晾干。 4) 配制的溶液应用0.1% DEPC，37℃处理12h以上，然后高压灭菌除去残留的DEPC；不能高压灭菌的试剂，用DEPC处理水配制，然后经0.22μm滤膜过滤除菌。 5) 操作人员戴一次性口罩、帽子、手套，手套要勤换。 6) 设置RNA操作专用实验室，所有器械等应为专用。 核酸提取方法 异硫氰酸胍-酚-仿抽提法 碱裂解法 溴化十六烷基三甲铵（CATB）抽提法 溴化乙锭-氯化铯（EtBr-CsCl）梯度离心法 寡聚脱氧胸腺嘧啶核苷酸（Oligo(dT)）-纤维素层析法 等。 三、分离提取核酸的主要步骤 （一）细胞的破碎 1 高速组织捣碎机捣碎 2 玻璃匀浆器匀浆 3 超声波处理法 4 液氮研磨法 5 化学处理法(SDS、LDS，吐温80等） 6 生化法（溶菌酶、纤维素酶等） 三、分离提取核酸的主要步骤 （二）核蛋白的解聚、变性蛋白的去除 1、SDS（十二烷基磺酸钠） 溶解细胞膜上的脂类与蛋白质，因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜，并解离细胞中的核蛋白，SDS 还能与蛋白质结合而沉淀； 2、蛋白酶K 能水解消化蛋白质，特别是与DNA结合的组蛋白； 3、机溶剂酚与氯仿： 抽提掉蛋白质和其它细胞组份。 （三）核酸的沉淀 实验X 总RNA的提取 实验X 总RNA的提取 实验X 总RNA的提取 四、核酸浓度的测定 2 紫外分光光度法测定核酸的含量 前提：核酸样品要较纯，无显著蛋白质、酚、琼脂糖及其他核酸污染。测定浓度应大于0.25 μg/ml。 结论：在波长260nm紫外光下，1 OD值的吸光度相当于双链DNA浓度为50μg/ml；单链DNA为37 μg/ml；RNA为40 ug/ml。 ？纯度： 测定待测样品在230nm、260nm 和280nm的OD值。 1 紫外分光光度计测定核酸浓度的操作步骤 a．吸取一定量的DNA样品或RNA样品，加水至特定体积后，转入分光光度计的石英比色杯中。 b．分光光度计先用一定量的水校正零点。 c．测定待测样品在230nm、260nm和280nm的OD值。 d．计算浓度。 双链DNA样品浓度(μg/μl) = OD260×核酸稀释倍数× 50/1000； RNA样品浓度(μg/μl) = OD260×核酸稀释倍数×40/1000。 e．分析纯度。 A、测DNA： 纯的DNA样品OD260/OD280应为1.8，OD260m／OD230应大于2.0。 1) OD260/OD280大于1.