原核生物的转录调控toupload2016年春.ppt

Lac操纵子的O1 回文结构 In Jacob and Monad’s model, the lac operon contained a single operator (O1).??However, two additional operators (O2 and O3) were subsequently discovered. In fact, there are three operators, the classical operator O1（major operator, 主操纵基因）, centered at position +11, the downstream auxiliary operator（辅助操纵基因） O2, centered at position +412, and upstream auxiliary operator O3, centered at –82. CAP is a positive regulator of the lac operon. 四聚体LacI蛋白和DNA的结合 1、四聚体LacI蛋白的两个单体通过DNA结合结构域与Lac操纵子的O1区（中心位于+11）紧密结合，结合位点为反向重复序列。 2、另一个二聚体的DNA结合结构域与O2（中心位于+412bp处）或O3（中心位于-82bp处）疏松结合，将DNA拉成环状。 阻遏蛋白lacI与DNA的结合是通过异构调控来调节的 阻遏蛋白结合诱导物后构型的变化： 1、 阻遏物由两个二聚体组成四聚体； 2、 二聚体的两个DNA结合域可以同时插入DNA大沟的两个相邻连续转角； 3、 诱导物（异乳糖）结合，改变了DNA结合域和核心区之间的角度方向，使二聚体两个头部不能同时和DNA结合，从而降低和操纵基因的亲和力 诱导物改变LacI在DNA上的分布，而不是产生游离阻遏蛋白： 随机DNA序列和阻遏蛋白也具有亲和力，但比操纵基因和阻遏蛋白的亲和力低107倍 诱导物和阻遏蛋白结合时，阻遏蛋白和操纵基因的亲和力下降，所有阻遏蛋白结合在DNA的随机序列上（并不形成游离蛋白质） 除去诱导物后，阻遏蛋白恢复活性，从随机位点直接转移到操纵基因上 阻遏蛋白总是与DNA结合在一起 问题 乳糖操纵子即使在阻遏蛋白的阻遏状态下，也有本底水平的基因表达（约为诱导时表达水平的0.1%左右），这是由于LacI与O也偶尔解离，使细胞中有极低水平的β-半乳糖苷酶及β-半乳糖通透酶生成。 1、抑制子LacI——负调控 2、葡萄糖——抑制Lac操纵子 葡萄糖的存在可防止从培养基中吸收其它碳源。当葡萄糖和乳糖同时存在于培养基中时，lac启动子表达受阻 3、CAP-cAMP复合物——正调控 Lac操纵子的调控因子 异乳糖 诱导物 乳糖 重排 β-半乳糖苷酶 透性酶 转乙酰酶? RNA聚合酶 LacI单体 LacI四聚体 lacI介导的lac操纵子基因表达的负调控机制 PEP,磷酸烯醇式丙酮酸 丙酮酸 PEP提供磷酸基团，Enzyme I (E1)直接被PEP磷酸化，磷酸化的E1将它的磷酸基团转移到HPr（磷酸载体蛋白 ），磷酸化的HPr是所有酶II（IIAGlc,IIB,IIC,IID）的磷酸基团供体：磷酸基团从HPr转移到EIIAGlc, 再到EIIB, 最终到达连接了葡萄糖的EIIC（有时会带上一个额外的链EIID），使葡萄糖发生磷酸化。 EIIAGlc EIIAGlc IIAGlc是葡萄糖专一的酶II，具有多种调节的相互作用。它影响腺苷酸环化酶、甘油激酶和非PTS通透酶（如：β-半乳糖通透酶）的活性 磷酸转移酶系统（Phosphotransferase System，PTS）：单糖转运系统 葡萄糖抑制Lac操纵子的分子机制 β-半乳糖通透酶 葡萄糖对Lac操纵子的分解代谢阻遏(catabolic repression) ： IIAGlc由于葡萄糖转运而去磷酸化，导致其结合β-半乳糖通透酶，从而阻止乳糖进入细胞。 Lac操纵子的正调控因子 功能：感知葡萄糖的缺乏，并通过激活lac promoter，使RNA聚合酶结合并转录结构基因。 lac operon的正调控因子为一个复合体：cAMP结合其受体（cAMP receptor protein, CRP）。CRP又称为“降解代谢物激活蛋白”（catabolite activator protein, CAP） 环化AMP cAMP-CAP复合物正调控的操纵子：lac, gal, ara等 CAP对cAMP介导的b-半乳糖苷酶的激活至关重要 提取wild-type和mutant的细胞提取物，分别加入不同量的cAMP进行体外生产半乳糖苷酶； 过多的cAMP间接