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酵母菌合成GSH诱导发酵及其催化活性比较研究邓小刚[1]★，廖雪蓉[2]，邢磊[2]，肖彦骏[2]，王少林[2]，丁彰琦[2]，廖鹏飞【3】，段学辉【4】※（南昌大学生命科学与食品工程学院，330031）[1]★南昌大学生命科学与食品工程学院生物科学082班，组长[2]南昌大学生命科学与食品工程学院生物技术081班【3】南昌大学生名科学与食品工程学院基础生物学实验中心【4】※南昌大学生命科学与食品工程学院生物工程系摘要:谷胱甘肽(GSH)是一种含巯基活性三肽，在人体内广泛分布，作为氧自由基清除剂，对于维持细胞的氧化还原状态起着重要作用。GSH的合成方法较多，目前主要以微生物发酵为主。本研究主要对不同酵母菌菌种、不同的发酵条件以及细胞内容物释放方式对合成GSH的催化活性进行比较，旨在寻找合成GSH酶催化活性最强的菌种，此外在一定程度上实现发酵条件的优化。研究发现：莫格球菌，栗酒酵母和酿酒酵母（GM2.129）的发酵合成GSH的催化活性较强，而酿酒酵母（GM2.128）的催化活性较弱；麦芽汁培养基与合成培养基相比，更适合酵母菌的生长与发酵；沸水浴和超声波破碎都具有促进细胞内容物的释放，但总体而言，超声波破碎效果更佳。关键词：谷胱甘肽；酵母；发酵；沸水浴；超声波破碎谷胱甘肽(glutathione，GSH)是一种具有重要生理功能的活性三肽，由谷氨酸、半胱氨酸及甘氨酸组成，GSH具有清除自由基、解毒、延缓衰老和抗疲劳等多种生理功效，在临床上用于肝脏保护、治愈肿瘤和治疗内分泌紊乱等疾病。近年来，随着谷胱甘肽更多的生理功能被发现，它在食品添加剂、临床医学和运动营养学上倍受关注，需求量不断增加，应用前景广阔。目前，GSH合成方法较多，其中以微生物发酵方法较为普遍，例如酵母发酵。目前已有研究人员对酵母发酵对培养基进行优化，此外紫外线诱变酵母等相关研究也有进行（胡林华等）【1】。但全面对不同种类酵母菌种发酵能力，及发酵条件探究尚未深入研究。本研究基于此，通过对栗酒酵母，酿酒酵母，莫格球菌等不同菌种的发酵能力比较，以及不同发酵条件对发酵能力的影响进行探究，成功选择出莫格球菌，栗酒酵母为较适合GSH合成发酵的菌种，而麦芽汁天然培养基较合成培养基更适合酵母菌的生长与发酵。此外，细胞内容物的释放对实验中酵母催化GSH合成的催化活性具有很大影响，细胞内容物释放情况直接关系到酶活性的测定。因此，本研究还比较了冰冻处理、沸水浴以及超声波破碎等方式进行了比较，总体而言冰冻处理效果要明显差与沸水浴和超声波破碎。本研究的主要意义在于，为GSH生物合成尤其是酵母发酵提供背景值，利于之后的相关研究。而由于研究所用的菌种数目相对较少，发酵条件优化程度有限，所以仍有很大一部分工作要做。1、材料和方法1.1 实验材料1. 1. 1 　菌种莫格球拟酵母GIM2.172，广东微生物研究所微生物菌种保藏中心。1.1.2 实验器材离心机（sigma生产）、分光光度计、恒温水浴锅、灭菌锅、超声波破碎仪，超净工作台等1. 1. 3　培养基 1.麦芽汁培养基：取一定量麦芽粉，加入4倍于麦芽粉重量的水，在60-65C水浴锅中保温糖化，并用搅拌器不断搅拌，糖化4个小时后，取出用纱布过滤，除去残渣，得到清亮黄色培养液。 2.合成培养基：蔗糖 8.0g；酵母提取物 0.5g；（NH4）2SO4 2.0g；KH2PO4。H2O 0.5g；MgSO4 0.2g；肌醇 0.2g；NaCl 0.2g。 3. 灭菌：各种培养基在121°条件下灭菌20min，1. 1. 4　主要试剂1.0.5mol/L 磷酸盐缓冲液：0.5mol/L 的 Na2HPO4。12H2O 溶液和0.5mol/L 的 NaH2PO4。2H2O 溶液按体积 84:16 的比例混合既得。2. 反应液：谷氨酸60 半胱氨酸20 甘氨酸20 Glc400 磷酸钾缓冲液100 六水合氯化镁403. 100ug/ml 标准GSH溶液：准确称取0.0100gGSH溶于蒸馏水中，定容至100ml得到100ug/ml的GSH标准溶液。4. 0.1mol/L 的四氧嘧啶（一结晶水）溶液（4℃冰箱保存）：准确称取1.6008g 四氧嘧啶，溶于蒸馏水中并定容至100ml容量瓶中即可。5. 0.1mol/L NaOH 溶液6. 1mol/L NaOH 溶液1.2 实验方法1.2.1斜面活化培养将酵母菌接种到斜面培养基上，30°48h培养后4°冷冻保存。1.2.2种子培养　从活化斜面上挑取一环菌体接入种子培养基中,30 ℃,150r/ min 培养1h ，并同时平板接种和6个摇瓶培养基中。1.2.3摇瓶培养种子培养好后以10 %的接种量,接入摇瓶培养基中, 28℃,200r/ min 培养48h 。离心收集细胞称湿重G