酶活測定方法.docVIP

二十、果蔬中多酚氧化酶活性的测定 一、目的要求 了解多酚氧化酶的作用，掌握果蔬组织中多酚氧化酶活性的测定方法。 二、基本原理 多酚氧化酶（Polyphenol oxidase，PPO）是一种以铜为辅基的酶，能催化多种简单酚类物质氧化形成醌类化合物，醌类化合物进一步聚合形成呈现褐色、棕色或黑色的聚合物。在后熟衰老过程或在采后的贮藏加工过程中，果蔬出现的组织褐变与组织中的多酚氧化酶活性密切相关。 多酚氧化酶催化邻苯二酚氧化形成的产物在420 nm处有最大光吸收峰。因此，可利用比色法测定多酚氧化酶的活性。 三、材料、仪器及试剂 （一）材料 梨、苹果、马铃薯等。 （二）仪器及用具 研钵、高速冷冻离心机、分光光度计、计时器、移液器、离心管、试管、容量瓶（100mL、1000 mL）。 （三）试剂 1．100 mmol/L、pH 5.5醋酸缓冲液 母液A（200 mmol/L醋酸溶液）：量取11.55 mL冰醋酸，加蒸馏水稀释至1 000 mL。 母液B（200 mmol/L醋酸钠溶液）：称取16.4 g无水醋酸钠（或称取27.2 g三水合乙酸钠），用蒸馏水溶解、定容至1 000 mL。 取68 mL母液A和432 mL母液B混合后，调节pH至5.5，加蒸馏水稀释至1 000 mL。 2．提取缓冲液（含1 mM PEG、4% PVPP和1% Triton X-100） 称取340 mg PEG 6000（聚乙二醇6000）、4 g PVPP（聚乙烯吡咯烷酮，Polyvinyl–polypyrrolidone），取1 mL Triton X-100，用100 mmol/L、pH 5.5醋酸缓冲液溶解、稀释至100 mL。 3．50 mmol/L邻苯二酚 称取275 mg邻苯二酚，用50 mmol/L、pH 5.5醋酸缓冲液溶解、稀释至50 mL。 四、实验步骤 （一）酶液制备 称取5.0 g果蔬组织样品，置于研钵中，加入5.0 mL提取缓冲液，在冰浴条件下研磨成匀浆，于4℃、12 000×g离心30 min，收集上清液即为酶提取液，低温保存备用。 （二）活性测定 取一支试管，加入4.0 mL 50 mmol/L、pH 5.5的醋酸缓冲液和1.0 mL 50 mmol/L邻苯二酚溶液，最后加入100 μL酶提取液，同时立即开始计时。将反应混合液倒入比色杯中，置于分光光度计样品室中。以蒸馏水为参比，在反应15 s时开始记录反应体系在波长420 nm处吸光度值作为初始值，然后每隔1 min 记录一次，连续测定，至少获取6个点的数据。重复三次。 五、实验结果与计算 1．将测定的数据填入下表 重复 次数 样品 重量 W (g) 提取液 体积V (mL) 吸取样 品液体积 Vs (mL) 420 nm吸光度值 样品中PPO活性 (△OD420·min-1·g-1 FW) OD0 OD1 OD2 OD3 OD4 OD5 △OD 计算值 平均值±标准偏差 1 2 3 2．计算结果 记录反应体系在420 nm处的吸光度值，制作OD420值随时间变化曲线，根据曲线的初始线性部分计算每分钟吸光度变化值△OD420。然后以每克鲜重（FW）果蔬样品每分钟吸光度变化值增加1时为1个PPO活性单位（U），则U = △OD420·min-1·g-1 FW。计算公式： 式中： △OD420——反应混合液的吸光度变化值； △t ——酶促反应时间，min； V ——样品提取液总体积，mL； Vs——测定时所取样品提取液体积，mL； W ——样品重量，g。 PPO活性还可以每分钟反应体系在波长420 nm处吸光度值变化增加1时所需的酶量为1个活性单位（U），表示为U = △OD420·min-1·mg-1蛋白质。酶提取液中蛋白质含量可利用考马斯亮蓝染色法进行测定。 六、注意事项 应进行预实验，测定每一分钟反应体系的吸光度值的变化，确定该酶促反应速度呈线性变化（初级反应）的时间段。这样，只测定某一段时间内反应溶液的初始吸光度值（OD0）和最终值（ODt）这两个数据，就可以计算每分钟吸光度值变化的增加量。 七、思考题 随着反应时间的延长，多酚氧化酶活性将呈现什么样的变化？（四）超氧化物岐化酶活性测定 一、目的要求 学习果蔬组织中过超氧化物歧化酶活性的测定原理和方法。 二、基本原理 超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）普遍存在于动、植物与微生物体内。SOD是含金属辅基的酶。高等植物有两种类型的SOD：Mn-SOD 和Cu/Zn-SOD。SOD能够清除超氧自由基（O2-），它与CAT、POD等酶协同作用来防御活性氧或其他过氧化物自由基对细胞膜系统的伤害，从而减少自