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酶的主要提取方法及其优缺点 生物工程09-1班 杨桠楠09011111125 1、有机溶剂沉淀是利用酶与其他杂质在有机溶剂中的溶解度不同，通过添加一定量的某种有机溶剂，使酶或杂质沉淀析出，从而使酶与杂质分离的。 优点：1）分辨率比盐析法高2） 沉淀不需脱盐3）溶剂易蒸发，沉淀易离心 缺点：1）有机溶剂易燃、易爆，对安全要求较高。2）对某些具有生物活性的大分子容易引起变性失活，操作需在低温下进行。沉淀析出后要尽快分离，尽量减少有机溶剂对酶活力的影响。 2、等电点沉淀是利用两性电解质在等电点时溶解度最低，以及不同的两性电解质有不同的等电点这一特性，通过调节溶液的pH值，使酶或杂质沉淀析出，从而使酶与杂质分离的 优点：1）大多数蛋白质的pI都在偏酸性范围内2）无机酸（如磷酸、盐酸、硫酸）价格较低3）无需除掉多余酸即可进行下一步纯化 缺点：1）酸化时，容易引起蛋白质失活 3、有机聚合物沉淀法(复合沉淀法)是在酶液中加入某些物质，使它与酶形成复合物而沉淀下来，从而使酶与杂质分离的。 优点：1）操作条件温和，不易引起生物大分子变性。2）沉淀效能高，使用少量的PEG即可沉淀相当多的生物大分子。3）沉淀后有机聚合物容易去除。 4、盐析沉淀法利用不同蛋白质在不同的盐浓度条件下溶解度不同的特性，通过在酶液中添加一定浓度的中性盐，使酶或杂质从溶液中析出沉淀，从而使酶与杂质分离 常用的盐析剂: 硫酸铵 优点：1）盐析能力强。2）在水中溶解度最大（25℃时为4.1mol/L）。而温度系数最小（对温度不敏感）。3）价格便宜。浓度高时也不会引起蛋白质和酶生物活性的丧失，抽提效果好。 缺点：1）缓冲能力差2）NH4＋的存在干扰蛋白质的测定3）得到的样品欲继续纯化时，需花一定时间脱盐。 5、双水相萃取技术是用两种不相溶的亲水性高分子聚合物水溶液，如聚乙二醇（PEG）和葡聚糖（Dextran）进行萃取。由于形成的两相均有很高的含水量（达70%?90%），故称“双水相”系统。 优点：1）每一水相中均有很高的含水量，为酶等生物物质提供了一个良好的环境；2）PEG、Dextran和无机盐对酶等无毒害作用，不会引起变性。3）平衡时间短、含水量高、截面张力小，特别适合于生物活性物质的分离纯化。4）操作简便5）易于放大 缺点：1）系统中水的含量高，分离后的物质浓度低，需经过浓缩等以提高浓度。2）含有高分子聚合物或盐类，在分离后需要进一步进行分离纯化，以除去高分子聚合物和盐类等杂质。 6、反胶团萃取是指表面活性剂（由亲水的极性基团和疏水的非极性基团两部分组成）分散在连续有机溶剂中自发形成的一种稳定的纳米级的聚集体进而达到分离的目的的。 优点：1）萃取率和反萃取率高。2）分离浓缩同时进行，溶剂可反复利用。3）解决胞内酶在非细胞环境中迅速失活问题。4）破壁功能，直接从完整细胞提取酶蛋白。5）成本低。6）极性“水池”具有较强的溶解能力。7）生物大分子由于具有较强的极性，可溶解于极性水核中，防止与外界有机溶剂接触，减少变性作用。8）由于“水池”的尺度效应，可以稳定蛋白质的立体结构，增加其结构的刚性，提高其反应性能。 7、超临界萃取是利用超临界流体的溶解能力与其密度的关系，即利用压力和温度对超临界流体溶解能力的影响而进行的。在超临界状态下，超临界流体具有很好的流动性和渗透性，将超临界流体与待分离的物质接触，使其有选择性地把极性大小、沸点高低和分子量大小的成分依次萃取出来。超临界流体（SCF）：当一种流体处于其临界点的温度和压力之下时。两相变为一相。 优点：1）密度接近液体－－萃取能力强2）粘度接近气体－－传质性能好3）超临界流体在超临界状态时具有密度大、粘度小、扩散系数大等优良的传质特性而成功开发的。4）具有提取率高、产品纯度好、流程简单、能耗低等优点。 最常用的超临界流体是CO2 优点：1）临界条件温和2）产品分离简单3）无毒、无害不燃无腐蚀4）性价格便宜 缺点：设备投资大 8、差速离心是采用不同的离心速度和离心时间，使沉降速度不同的颗粒分批分离的方法。 优点：操作简单，离心后用倾倒法即可将上清液与沉淀分开，并可使用容量较大的角式转子。缺点：1）分离效果差，不能一次得到纯颗粒。2）壁效应严重，特别是当颗粒很大或浓度很高时，在离心管一侧会出现沉淀。3）颗粒被挤压，离心力过大，离心时间过长会使颗粒变形，聚集而失活。 9、密度梯度离心（速度区带离心）样品在密度梯度介质中进行离心，使沉降系数比较接近的组分得以分离的一种区带分离方法。 优点：一次离心就能同时纯化不同大小的颗粒，而不必分开进行。 缺点：1）离心时间要严格控制，既有足够的时间使各种粒子在介质梯度中形成区带，又要控制在任一粒子达到沉淀前。如果离心时间过长，所有的样品可全部到达离心管底部；离心时间不足，样品还没有分离。2） 此法是