免疫组化PV二步法与SP三步法比较.docVIP

免疫组化PV二步法与SP三步法比较 　　摘要：目的 比较免疫组化PV二步法和SP三步法。方法 通过两组不一样的试剂盒来对一样的胃癌常规石蜡标本进行研究，比较免疫组化PV二步法和SP三步法在相同组织上的不同表达。结果 与二步法相比，三步法制片结果的阳性率和背景低，非特异性着色小，结果比较明确易读；而与三步法相比较，二步法的操作更加简单方便，检查阳性率和阳性强度更高。结论 面对一抗为C-MET的免疫组化染色，三步法的实验时间虽然更长，但是实验结果明确易读，对于科学研究比较适用。二步法则容易得出结果，阳性强度、灵敏度和假阳性率更高，容易出背景着色，对于科学研究不适用，但是因为二步法操作更加简单方便，阳性检出率更高，在诊断C-MET弱表达患者时漏诊率低，得到结果的时间更短，所以适合用于临床病理诊断。 　　关键词：免疫组化；二步法；三步法 　　免疫组化技术就是通过已知的特异性抗体和抗原的特异性结合，来对细胞或者组织内某物质性质进行检测，同时通过酶作用于底物所产生的颜色反应来对物质在细胞内的分布情况进行显示[1]。随着免疫酶标技术的发展，免疫组化技术也得到了快速的发展和完善，在临床诊断和科研中免疫组化技术的应用也越来越广泛。本研究选择C-MET作为目的指标，对免疫组化二步法和三步法在C-MET检测中的差异进行了观察，分析了两组方法在实际使用中的差异。 　　1资料与方法 　　1.1一般资料 选择胃癌常规石蜡标本。选择C-MET兔抗人多克隆抗体，胞浆着色表示阳性。二步法PV-9000试剂盒和三步法SP超敏试剂盒分别选购于两个不同生产厂家。 　　1.2方法 选择已知为阳性的乳腺癌组织作为阳性对照，选择PBS替代一抗作为阴性对照。DAB显色，严格按照相关的说明书来进行染色。三步法的具体操作如下：①对石蜡切片进行常规脱蜡直到水化，利用PBS对其进行3次冲洗，冲洗时间为3 min/次；②利用EDTA缓冲液进行浸泡，进行2 min的高压修复，暴露抗体；③切片加入150 Ll过氧化酶阻断溶液，在室温下进行10 min孵育，从而来讲内源性过氧化物酶活性阻断。采用PBS进行3次冲洗，冲洗时间为3 min/次；④将PBS液去除，每张切片加正常非免疫动物血清150Ll，在室温下进行10 min孵育；⑤将血清去除，每张切片加入第一抗体150 Ll；⑥采用PBS冲洗3次，冲洗时间为3 min/次，之后将PBS液去除，每张切片加入生物标记的第二抗体150 Ll，在室温下进行10 min孵育，之后利用PBS冲洗3次，冲洗时间为3 min/次；⑦将PBS液除去，每张切片加入链霉菌抗生物素-过氧化酶溶液150 Ll，在室温下进行10 min孵育，之后利用PBS冲洗3次，冲洗时间为3 min/次；⑧将PBS去除，每张切片加入新鲜配置的DAB600Ll，在显微镜下进行3～10 min的观察；⑨采用自来水进行冲洗，苏木素复染，自来水冲洗反篮或者在冲洗之后利用PBS快速反蓝；⑩采用梯度酒精进行脱水干燥，二甲苯透明，中性树胶进行封固。 　　二步法和三步法相比，4～7的操作不同，二步法不采用正常血清进行封闭，直接加入第一抗体过夜，之后加入特异性二抗，其余操作步骤则和三步法相同。 　　1.3统计学方法 将数据纳入SPSS 19.0统计软件中进行分析，计数资料比较采用χ2比较，以率（%）表示，若（P0.05）则差异显著，有统计学意义。 　　2结果 　　与二步法相比，三步法制片结果的阳性率和背景低，非特异性着色小，结果比较明确易读；而与三步法相比较，二步法的操作更加简单方便，检查阳性率和阳性强度更高。 　　3讨论 　　二步法也被称之为非生物素酶法，二步法中的第二抗体是将特异性抗体和辣根过氧化物酶利用多聚糖骨架连接成多聚体[2]。通过PV系列二步法免疫组化检测试剂，在氨基酸骨架上将二抗抗体分子和酶聚合在一起，形成一种多聚体，从而来代替传统方法中的三抗和二抗，让抗原和抗体的结合信号得到有效放大，防止再次采用生物素，之后在利用DAB呈色反应来对抗原表达部位进行观察。 　　三步法也被称之为生物素酶法，实验室采用的SP超敏试剂盒主要是利用链霉素抗生物蛋白-过氧化物酶链接系统来进行设计的。利用生物素对第二抗体进行标记；选择从链霉菌中分离出的蛋白质作为链霉菌抗生物素蛋白，这种蛋白质的分子量为60KD，包含有亚基4个，每一个亚基都具有和生物素进行相连的部位，而且亚基和生物素之间的亲和力比较强。链霉菌抗生物素蛋白和过氧化物酶形成链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶复合体；生物素化的第二抗体和链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶复合体，利用DAB呈色反应能将抗原抗体的结合部位有效显示出来[3]。 　　本研究结果发现，与二步法相比，三步法制片结果的阳性率和背景低，非特异性着色小，结果比较明