重組质粒的酶切和PCR验证-郑小煜.docxVIP

重组质粒的酶切和PCR验证姓名：郑小煜学号：201100140069班级：11级生物技术班同组者：赵莉、高瑞【实验目的】检验重组质粒的插入片段的大小学习和掌握PCR反应的基本原理和实验技术。【实验原理】重组质粒酶切鉴定将含有外源DNA的转化子的E.coliDH5α菌株进行培养，并用试剂盒提取其质粒DNA，将所提取的DNA用切pUC19质粒的同一种限制性内切酶进行切割以验证所插入的外源DNA的大小。引物设计1、引物体内，引物是一段与模板DNA互补的RNA单链体外PCR反应中，引物是人工合成的两段寡核苷酸序列，分别与靶DNA模板的两端互补，从而界定了产物的范围引物能否与靶DNA特异结合，决定了PCR的特异性；引物能否被DNA聚合酶有效延伸，决定了PCR的灵敏性。2、引物设计原则长度：15-30nt，longPCR或某些特殊的PCR需使用较长的引物。碱基分布：随机分布，同一碱基不应连续出现超过4次。GC含量：一般40-60%。太低会导致引物Tm值较低，不利于PCR的特异性；太高则不利于引物结合，亦能引发非特异扩增。→Tm值(55℃-65℃)过低，PCR特异性低；过高，PCR效率低，特异性差。（引物设计软件和公司合成时都会直接给出Tm值。）引物二聚体：尽可能避免两引物的3`端有较多碱基互补。发夹结构：避免引物3`端产生发夹结构。3`端：需与模板DNA严格配对，不能有任何修饰；最后一个碱基最好不与密码子第三个碱基配对；最后1-2nt最好不要用T/A；→PCR灵敏性：引物二级结构的存在可能影响与其模板的特异、有效结合；3`端的错配则会影响DNA聚合酶的有效起始。引物5`端：可引入与模板DNA不配对的碱基，如：限制性核酸内切酶识别序列，以方便克隆操作；加各种寡核苷酸接头（adaptor\linker）；可改变某个碱基，从而在产出物中引入点突变；可利用放射性物质或非放射性物质（如生物素、地高辛等）进行标记，以方便后续分析、检测。→PCR的灵活性和多用途。PCRPCR（Polymerase Chain Reaction）即聚合酶链式反应是1986 年由Kallis Mullis 发现。这项技术已广泛地应用于分子生物学各个领域，它不仅可用于基因分离克隆和核酸序列分析，还可用于突变体和重组体的构建，基因表达调控的研究，基因多态性的分析等方面。本次实验旨在通过学习和掌握PCR反应的基本原理和实验技术，以验证重组质粒插入片段大小。聚合酶链式反应原理PCR是一种利用两种与相反链杂交并附着于靶DNA两侧的寡核苷酸引物，经酶促合成特异的DNA 片段的体外方法。反应体系包括：模板DNA、寡核苷酸引物、Mg2+，4种脱氧核糖核酸（dNTP）、DNA聚合酶和合适的缓冲体系。反应过程由高温变性，低温退火和适温延伸等几步反应组成一个循环，然后反复进行，使目的的DNA 得以迅速扩增。置待扩增DNA 于高温下解链成为单链DNA 模板，人工合成的两个寡核苷酸引物在低温条件下分别与目的片段两侧的两条链互补结合，DNA聚合酶在72℃将单核苷酸从引物3端开始掺入，沿模板5—3方向延伸，合成DNA 新链。由于每一循环所产生的DNA均能成为下一次循环的模板，所以PCR 产物以指数方式增加，经25—30次周期之后，理论上可增加109倍，实际上可增加107倍。PCR 技术具有操作简便、省时、灵敏度高、特异性强和对原始材料质量要求低等优点，但由于所用的TaqDNA聚合酶缺乏5—3核酶外切酶活性，不能纠正反应中发生的错误核苷酸掺入，估计每9000个核苷酸会导致一个掺入错误，但是错误掺入的碱基有终止链延伸的作用倾向，使得错误不会扩大。2． PCR的反应动力学PCR技术类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。到达平台期(Plateau)所需循环次数取决于样品中模板的拷贝。3． PCR扩增产物可分为长产物片段和短产物片段两部分。短产物片段的长度严格地限定在两个引物链5’端之间，是需要扩