流式细胞术在白血病诊断中的应用剖析.ppt

流式细胞术在白血病诊断中的应用 四川大学华西医院血液科 朱焕玲 一 简介 FCM：集激光、电子、光电测量、计算机、荧光化学、单抗的高科技仪器。 对处在快速直线流动状态中的单个细胞或生物颗粒进行多参数的、定量分析和分选的技术。 分两类：台式机（临床型） 大型机（cell sorting).科研用。 FCM的结构 FCM的结构 细胞流动室； 光源； 聚光系统； 信号检测器； 电子计算机； 细胞分选装置。 数据的存储、显示与分析 数据的存储：listmode 显示： 单参数直方图(histgram); ：常用于分析DNA等； 双参数：二维点图等（dot plot) ； 等高图：(contour) 三维等高图：3D plot 设门（gating): Data Acquisition - Listmode Immunofluorescence FCM检测常用参数内部参数—散射光测定 前向角散射(forward scatter FSC):与激光束平行的信号。与被测细胞大小有关。 侧向角散射（side scatter SSC):与激光束呈90°的光信号。与细胞内结构和颗粒物质多少有关。 采用FSC、SSC组合，可区分淋巴细胞、单核细胞、粒细胞等群体。 FCM常用参数外部参数—荧光测量 荧光素探针标记的细胞所发荧光。 荧光信号强弱、多少与细胞的抗原量、内含物多少有关。 常用的荧光显色剂： FITC： PE：藻红蛋白 PerCP； PI：碘化丙啶，测定DNA含量。 临床常用三色荧光检测，现有四色分析。 CD45 vs SSC设门 CD45为造血细胞（红系除外）的共同抗原。避免杂质细胞的沾染。 在FCM分析时特别注意： 细胞的分化成熟、细胞内部结构及其分化抗原的逐渐增减是渐进过程，非突变。故同时获知一个细胞的多种参数方能正确判断细胞属性。 当细胞发生克隆增殖后，可出现抗原量变、丢失和错译表达。 细胞抗原的阳性率及荧光强度是同等重要的指标。 FCM可采用的标本 单个细胞，新鲜标本，抗凝保存： PB； BM；（有时BM活检标本） LN（包括FNA）； CSF； 组织浸润FNA 或活检标本； 急性白血病FCM分析 白血病细胞的抗原表达一定程度遵循正常细胞抗原表达的规律。 白血病细胞为肿瘤性生长，可出现正常细胞表达以外的异常现象，如缺失、错译表达等。 目前未发现白血病特异性抗原，须多参数分析。 临床原/幼细胞群定性比定量更为重要。 抗体的选择： 常用抗体选择： 核心McAbs:确定淋系或髓系（系特异性） 髓系：CD33、CD13、CD14，cMPO B-cell: CD19、CD10、cCD22 CD20 T-cell:CD7、CD2、CD5、cCD3 红系：GlyA 巨核细胞：CD41、CD61 非系列特异性：CD34、DR、CD45 AL panel CD7/CD117/CD45---protocal HLA-DR/CD13/CD45 CD14/CD2/CD45 CD19/CD5/CD45 CD33/CD34/CD45 CD20/CD10/CD45 CD64, 117,13,33,14,64—myeloid 19,10,20—B lineage 7,2,5—T lineage DR,34 immature AML常见CD表达 正常骨髓的FCM二维点图 ALL常见CD表达 未分化和双标白血病 AUL：仅占1% 典型的AUL：DR+，CD34+ with no lineage-specific antigens. Biphenotypic leukemia(mixed):仅有7%能严格符合此型。过度诊断是由于： 未排除非白血病细胞； 非特异性结合； 某些抗体缺乏系特异性； 特异性抗原为： B—cCD22; T—CD3; M—MPO; Scoring syetem for the definition of biphenotypic AL Points B-淋巴 T-淋巴 髓系 2 cCD79a cCD3 cMPO CD22 TCRab cIgM TCRrd