湿热灭菌工艺的微生物学验证详解.ppt

* 多孔/坚硬装载程序的确认 多孔/坚硬装载生物指示剂确认中所用的生物指示剂主要由市场购得，它们可以放置在纸上、不锈钢、铝或其他基质上。另一种可选的方式，是将孢子接种在设计的试样上。密封在安瓿中的生物指示剂可能并不能反映多孔/坚硬装载的实际情况。 将BI挑战系统放置在物品加热最慢的部位--最难灭菌的部位。例如，这些部位可能存在于筒式过滤器的褶皱中，或者在长软管的中部（那里可能夹带空气），或者在蒸汽难以穿透的橡胶塞与瓶的密封口上。 * BI验证中常见的问题 BI无出厂证或证书不符合要求 供货商不提供每个单元中的BI数量 无耐热性数据 BI验证的实测结果与理论计算相差太大 市售BI的耐热性高，产品不能经受过度杀灭，企业不知道如何接种初始菌量 许多人不知如何计算，如何评估 * BI初始量及D值的确定 PDA TR No1 2007提出以下公式： LgNF= LgN0-F(T,Z)/DT，即 LgN0=LgNF＋F/D （见第52页幻灯片中的等式1） F 灭菌程序设计期望获得的杀灭力/灭菌时间 D 挑战试验中BI的耐热性 N0 挑战菌的起始浓度（接种量） NF 灭菌程序结束后，挑战菌的存活数量。为了方便计算，如果将挑战菌全部杀灭，可以认为存活数小于1，在此等式中，可取NF为10E0表示。 * 孢子液的使用要求 孢子在标准溶液中的耐热性 ≥孢子在产品溶液中的耐热性 孢子的耐热性在标准溶液中比较稳定 有孢子在标准溶液中的耐热性资料 标准溶液更方便于制备和检测 适用于替代灭菌程序相近的不同产品的灭菌工艺验证 生物指示剂的D值测定方法（另文） * 实例分析 * 1.　D值的测定 实例分析 * D值的影响因素 物理、化学条件、环境因素、湿度，如： 孢子所处的介质、测试温度、内包装材料 灭菌时间（由加热和冷却滞后所致的影响） 加热和培养计数之间的温度、时间和环境条件 用来培养计数灭菌后孢子的培养基等 芽孢是否处于被包裹状态，此状态会使其耐热性大大增强 微生物的耐热性（或统称对灭菌剂的耐受性） * D值的影响因素-续 影响微生物的耐热性因素还包括： 在氯化钠或氯化钾存在条件下，G..嗜热脂肪杆菌的耐热性会增强； 在二价钙离子和镁离子存在时，B.凝结芽孢杆菌的耐热性也会增强； 在钾离子存在的情况下，C.梭状芽孢梭菌的耐热性会增强 鳌合剂的存在（如柠檬酸）也会影响耐热性，强鳌合剂可以竞争性作用周围的离子，使包衣式芽孢的耐热性产生变化。 在接种的载体上（例如纸或橡胶），也可观察到相似的耐热性差异。…… DT值的确定方法 Direct Enumeration Method 直接计数法 又称 Survival Curve Method 残存曲线法 Fraction Negative Method 阴性分数法 - Spearman-Karber Method 史丕曼- 卡伯法 - Stumbo, Murphy, and Cochran Method D值测定仪器 Biological Indicator—Evaluator Resistometer (简称BIER/Vessel) 油浴装置 – 用于残存曲线法 D值测定仪器的典型温度曲线 温 度 时间(分钟) 残存曲线法测定D值 仪器及材料 油浴（适宜的温度范围，精度，容量） 毛细管与支架 试验用芽孢悬浮液准备 工作悬浮液占试验悬浮液比例不超过10% 每0.05ml试验悬浮液中中的芽孢为106 - 108 确定试验参数 数据分析 线性回归和相关系数要求 Y = mX + b，m=(Y∑X - ∑XY)/(X∑X-∑X2) γ = mδX/δY 实测数据 121.1±0.5 oC下梭状芽孢杆菌孢子 在PBS中的存活数量 时间 (min) 存活数量(CFU) 对数值 0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 1.7×105 3.1×104 5.0×103 1.3×103 4.0×102 4.0×101 5.24 4.49 3.70 3.11 2.6 1.60 D值计算 121.1±0.5 oC下梭状芽孢杆菌孢子 在PBS中的存活曲线 1. 根据曲线进行测量： 任选两个对数值的整数值， 找到相对应的灭菌时间 用时间差除以对数差，得D值 惯用法： 测出一个对数单位的时间差 如图示: 3.1-1.7 = 1.4 (分钟) 2. 利用EXCEL平台直接计算 残存曲线斜率，再取负倒数 D = - 1/(-0.6989) = 1.43 (分钟) * 2.　接种量计算 实例分析 * 示例-1 按产品特性设计期望的最小F为6.0分，预期BI残存数NF=100，D为1.2分。挑战试验用的