烟草151-李春黎-植物原生质体培养课件详解.ppt

2、原生质体的培养方式： ⑴固体培养 （平板培养） 琼脂培养基与原生质体溶液混合摇匀，倒平板，薄层培养。 特点：容易观察、统计原生质体的分裂情况，但操作比较复杂。 进行平板培养时，要注意混合时培养基的温度；平板培养在以后添加新鲜培养基和转移培养物方面也要复杂些。 ⑵液体浅层培养 将含原生质体的培养液倒入培养皿底部，使其成一薄层，封口后进行培养。 特点： 操作简单，对原生质体的损伤小，而且方便以后添加新鲜培养基和转移培养物 原生质体分布不均匀，常常发生原生质体之间粘连，从而影响其进一步的生长、分裂 原生质体的位置不能固定，所以不能跟踪观察单个原生质体的生长过程。 ⑶液体—固体结合培养 ①液体浅层—固体平板培养双层培养法 培养皿底部铺一层琼脂或琼脂糖培养基，再将原生质体悬浮液倒入或滴入固体培养基表面。 特点：固体培养基中的营养可以缓慢释放到液体培养基中 如果在固体培养基中加入活性炭，还可以吸附培养物分泌的有毒物质，促进原生质体的生长和分裂 （4）琼脂糖珠培养： 用移液管吸取含原生质体的琼脂糖培养基，滴在三角瓶中，待其凝固后，再加入适量的液体培养基进行振荡培养。 特点：改进了培养物的通气和营养环境，从而促进可以促进原生质体的分裂及细胞团的形成。 3、培养条件 ⑴植板密度：104 ～ 105个/mL ⑵散射光或黑暗 ⑶温度：25 ～30 ℃ （三）原生质体的发育和植株再生 原生质体→ 形成新的细胞壁→ 第一次分裂 →小细胞团 →愈伤组织 →再生苗 1 细胞壁再生 原生质体数小时后开始形成新的细胞壁，一至数天内便可形成完整的细胞壁 2 细胞分裂和生长 在细胞分裂开始以后，培养基中的甘露醇或山梨醇的浓度要逐渐降低，否则会影响细胞的继续生长、分裂。 新细胞 2-7d 第一次分裂 2w后 多细胞的细胞团 3w后 小细胞克隆 约6w后 直径1mm的小愈伤组织 低渗透压 3 植株再生 将愈伤组织转移到分化培养基上继续培养。 愈伤组织将通过形态发生的两条途径即器官发生或胚胎发生形成再生植株。 夜来香 1d 5d 7d 10d 4周 5周 7周 苜蓿原生质体分裂 6 weeks 8 weeks 苜蓿原生质体形成细胞团 苜蓿原生质体再生植株 THANK YOU * * * 植物原生质体培养 烟草151 李春黎 01 植物原生质体培养的定义及其应用 植物原生质体(protoplast)：植物细胞除去细胞壁后所剩下的部分。即是没有细胞壁的裸露细胞 原生质体概况 植物原生质体研究进展 1960年，Cocking首次应用酶法制备番茄根原生质体获得成功。 1968年，Takebe et al.首次获得烟草叶肉原生质体培养再生植株。 1985年，Fujimura et al.世界第一例禾谷类作物－水稻原生质体培养获得再生植株。 应用： 1.体细胞杂交：实现远缘物种的体细胞杂交，再通过植株再生就可能创造出新的植物个体 2.遗传转化：实现外源DNA或细胞器的导入，通过植株再生就可以得到转基因植物 3.分离细胞器的理想材料 4.无性系变异及突变体的筛选 植物原生质体的分离 02 （一）原生质体的分离与收集 高产量、高质量的原生质体是进行原生质体培养和操作的前提。 步骤： 1.材料的选择； 2.酶解处理； 3.原生质体的分离、纯化； 4.原生质体的活力检测。 1、材料的选择 1）取材 细胞分裂旺盛的材料 双子叶植物：幼嫩小苗的根、胚轴、子叶、幼叶 单子叶植物（禾本科植物）：愈伤组织或悬浮细胞 2）预处理： 有菌材料，必须进行表面消毒处理； 暗处理； 叶片萎蔫处理，撕去下表皮； 质壁分离处理； 悬浮细胞or愈伤组织预培养。 2、 酶解处理 ⑴ 配制酶解液 ⑵酶解 ⑴ 酶解液 酶 酶溶剂（膜稳定剂，pH稳定剂） 渗透压稳定剂 ① 酶类 植物细胞壁的主要成分：纤维素、半纤维素和果胶质（连接细胞中间层） 分离植物原生质体的酶根据作用分为:纤维素酶、半纤维素酶和果胶酶 ② 酶溶剂 无机离子：提高质膜的稳定性；也可以提高原生质体活力 牛血清白蛋白：防止酶解过程对细胞膜和细胞器的破坏 pH缓冲剂：保持酶解液的酸碱环境的稳定，增加原生质体的释放量和原生质体的稳定性。 ③ 渗透压调节剂 目的：维持等渗环境，保证释放出来的原生质体的活力和膜稳定性 常用物质：葡萄糖、甘露醇和山梨醇等，浓度一般为0.35-0.8mol/L。具体用什么浓度，要根据材料的特点来确定。 酶解液配制好后，要用过滤灭菌的方法进行灭菌，并且随