辛辣刺激下香料和防腐剂对小鼠变应性接触性皮炎免疫机制的比较.doc

第二部分 辛辣刺激下香料和防腐剂对小鼠变应性接触性皮炎免疫机制的比较 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 实验动物 　由延边大学医学部实验动物中心提供体重-24 g，市售度酒精） 主要仪器设备 生产公司 OLYMPUS 光学显微镜 日本产 Sony全自动数码照相机 日本产 KD-T电脑生物组织摊烤片机 浙江金华科迪仪器设备有限公司 LEICA820型石蜡切片机 德国产 YB-6L生物组织石蜡包埋机 湖北省孝感市亚光医用电子技术研究所 电热恒温干燥箱 湖北省黄石市医疗器械厂 TD2000彩色病理图像分析系统 北京产 台式低速离心机 北京产 微量可调移液器 德国产 Multiskan 酶标仪 上海热电仪器有限公司 1.2 实验方法及过程 1.2.1 实验分组 将210只雌性昆明小鼠随机分为七组：A、B、C、D、E、F、G。空白对照组（A组），肉桂醛组（B组），辛辣肉桂醛刺激组（C组），咪唑烷基脲组（D组），辛辣咪唑烷基脲刺激组（E组），肉桂醛、咪唑烷基脲混合组（F组），辛辣肉桂醛、咪唑烷基脲混合组（G组）各30只。 1.2.2 小鼠变应性接触性皮炎模型建立 同第一部分模型的建立。 1.2.3 血清采集及背部组织标本制备 将小鼠摘眼球取血后，将小鼠背部皮肤剪下投入4％多聚甲醛固定液中固定。将血液静置后离心，收集上层血清置于-70℃冰箱以备检测细胞因子的水平。 1.2.4 小鼠脾指数和胸腺指数测定 脾指数=[脾重量/(小鼠体重/10)] ×100%，胸腺指数=[胸腺重量/(小鼠体重/10)] ×100% 1.2.5 肝肾组织学检查 将肝肾组织取出做病理组织切片，HE染色，光镜下观察有无病理变化。 1.2.6 皮肤组织形态学1）细胞组织脱水、透明、浸蜡石蜡包埋 （2）组织切片 进行切片，厚度5 μm，将切片凉水中展开后贴于载玻片上，再在漂片机中奖载玻片上的切片更好的固定于载玻片上之后在烤片机上烘干。 （3）HE染色 蓝化（50℃左右温水）数分钟 皮肤组织学评分抗体的染色等级判定标准由2位经验丰富的病理医师进行双盲阅片表 依照阳性细胞数量积分标准 阳性细胞百分比 积分 无阳性 0 0 25% 1 25%-50% 2 51%-75% 75% 3 4 表4 依照免疫组化着色强度积分标准 着色强度 积分 未见染色 0 轻度染色（淡黄色） 1 中度染色（棕黄色） 2 重度染色（棕褐色） 3 阳性细胞百分比数量积分与着色强度积分相加的方法，判断0分为（-），2-3分为（±），4-5分为（+），6-7分为（++），其中（+）、（++）判断为阳性。 （3）显统计方法）表示，两组间比较采用ｔ检验；计数资料采用方差分析；率的比较采用卡方检验进行比较，当P0.05时差异有统计学意义。 结果 .02）。A组与B、C、D、E、F、G组比较有统计学意义（P0.05）。A组胸腺指数（mg/g）为（4.3±1.12）， B组、D组、F组脾指数（mg/g）为（6.96±1.78），C组、E组、G组脾指数（mg/g）为（8.63±1.35）。A组与B、C、D、E、F、G组比较有统计学意义（P0.05）。脾指数及胸腺指数与对照组比较有明显增加, 与之前研究结果一致[17]。 2.2 小鼠肝肾组织学检查 各组小鼠肝、肾病理切片在光镜下观察均无明显病理变化。说明实验中肉桂醛及咪唑烷基脲的使用剂量没有肝肾毒性。 小鼠肝组织图片（HE×100) 小鼠肾组织图片（HE×100) 2.3 皮肤组织病理评分及检测结果 A组皮肤表皮完整表面附有量角化层，皮肤毛发结构丰富，真皮内较多的纤维细胞及胶原纤维，未见炎细胞浸润（图），明未引起皮肤组织病理变化评分为0病理显示（P0.0组织病理学显示 P0.05）（表5）。 D组与E组组织病理学检测显示：D组皮肤结构基本完整，棘层有轻度增厚，可见角化过度，皮肤表层有少量炎症细胞浸润，（图8E）；E组可见皮肤棘层增厚，角层增厚，真皮结缔组织血管扩张充血，细胞间水肿，表皮下、脂肪层大量炎症细胞浸润（图8F）。病理评分两组间有统计学意义（P0.01）（表5）。 F组与G组组织病理学检测显示：F组病理表皮结构不完整，表皮有脱落坏死，细胞间、细胞内水肿，表皮下、脂肪层有大量炎症细胞浸润（图8G）；G组可见表皮坏死脱落，真皮结缔组织血管扩张充血，胶原组织变性，表皮下及脂肪层大量炎症细胞浸润（图8H），病理评分结果无统计学意义（P0.05）（表5）。 表5各组小鼠