【2017年整理】一种依赖HrpB独立于Ⅲ型分泌系统的胞外天冬氨酸蛋白酶作为青枯菌的一种毒力因子.docx

一种依赖HrpB独立于Ⅲ型分泌系统的胞外天冬氨酸蛋白酶作为青枯菌的一种毒力因子 周大祥 生物工程学院基因工程中心 学号：20111901005 摘要：宿主特异性的青枯菌能够引起多种茄科植物萎焉，但对其认识还是很少。为了鉴定细菌的一个宿主特异性基因，选择典型菌株SL341（对辣椒有致病力，番茄无致病力）和SL2029（对番茄有致病力，辣椒无致病力）。我们发现来自SL2029的rsa1基因对SL341菌株失去辣椒萎焉能力。Rsa1基因编码一个11.8KDa的蛋白质，该基因上游有完整的共有hrpⅡ盒模体。尽管rsa1基因表达由HrpB—一种hrp基因表达的转录活性因子—激活，但Rsa1蛋白与天冬氨酸蛋白酶、组织蛋白酶D同源性较差，Rsa1蛋白拥有蛋白酶活性。两种特异性的天冬氨酸蛋白酶抑制剂抑肽素A和邻重氮乙酰-D,L-正亮氨酸甲酯能抑制该酶活性。将54和59位的天冬氨酸用丙氨酸取代，也会失去蛋白酶活性。SL2029菌株的rsa1突变体与野生型菌株相比毒力大大降低，不会引起辣椒萎焉症状。结果表明Rsa1蛋白是一种胞外天冬氨酸蛋白酶，在SL2029菌株侵染番茄扮演重要的作用。 引言 当植物在自然界遭遇致病菌时，致病菌有其特异性的易感宿主，它们能够定殖并成功的侵染。为了区分宿主-致病菌相互作用的特异性，通常会用到各种基因型和抗病品种。宿主特异性形成致病菌生理小种，它是由宿主抗性蛋白与致病菌无毒蛋白之间的直接或间接相互作用决定(Chisholm et al., 2006)。大多数细菌的无毒蛋白作为一种效应分子，经由宿主过敏性反应和致病菌Ⅲ型分泌系统(T3SS)进入植物细胞(Cornelis and Van Gijsegem, 2000; Mudgett, 2005; Staskawiczet al., 2001)。众所周知，效应蛋白具有酶活性，能提高细菌的毒力，T3SS对致病菌侵染植物是必须的(Mudgett,2005; Staskawicz et al., 2001)。在某些抗性植物中，抗性蛋白识别细菌的无毒效应分子，因此产生抗性(Chisholm et al., 2006)。 我们对青枯菌的宿主特异性非常感兴趣，青枯菌能够引起全球主要的经济作物，比如番茄、土豆、烟草、花生和香蕉等萎焉，入侵木质部导管。不像其他的植物致病菌，青枯菌通常根据侵染不同的植物分成生理小种。该菌有广泛的生理和遗传多样性，根据宿主范围被分成7个生化型和5个生理小种(Hayward, 1991)。生理小种1菌株最常见，能侵染许多茄科植物，如番茄、烟草和辣椒等，生理小种3菌株对土豆具有高致病性，而对辣椒无致病力(Boucher et al.,1985)。 为了理解青枯菌的致病分子机制，hrp基因簇主要编码T3SS蛋白，改基因簇被深入研究(Cunnac et al., 2004a, b)。基于生理小种1菌株GM1000和RS1000基因组信息，依赖于T3SS的效应分子报道较多(Mukaihara et al., 2010; Poueymiro and Genin, 2009)。因为没有对5中生理小种抗病的植物，所以很难解释基因-基因相互作用。来自青枯菌株AW1的avrA基因负责诱导烟草过敏反应，该基因被克隆，AW1菌株Avr突变体失去诱导烟草过敏反应的能力，对烟草不致病(Carney and Denny, 1990)，是另外的对烟草无毒力基因(popP1）存在的结果。当另一个avr基因缺失时，avrA基因表现为一种典型的avr基因(Poueymiro and Genin, 2009)。 popP1和popP2是青枯菌的两个avr基因，在GM1000菌株中被鉴定(Deslandes et al., 2003; Lavie et al., 2002)，popP1和popP2基因表达依赖于关键的转录因子HrpB，该因子控制大多数hrp基因表达(Deslandes et al., 2003; Lavie et al.,2002; Occhialini et al., 2005)。PopP1基因表现为典型的avr基因，对矮牵牛花无致病力(Lavie et al.,2002)。PopP1和PopP2蛋白是T3SS效应蛋白，属于YopJ/AvrRxv家族，与类泛素蛋白酶1相似(Deslandes et al., 2003; Lavie et al., 2002)。PopP2被拟南芥生态型Nd-1的RRS1-R识别，PopP2和 RRS1蛋白定位在细胞核(Deslandes et al., 2003)。然而，和其他叶致病菌相比，还是不能解释青枯菌和天然宿主之间的基因-基因抗性。 结果 rsa1基因鉴定 我们选择SL341菌株和SL2029菌株，SL341菌株对番茄