111009TRAP試剂盒使用手册V1点1.doc

细胞生物学系列 CAT#:111009-50 低温运输,-20℃保存 TRAP试剂盒 TRAP Kit 使用手册V1.1 北京天恩泽基因科技有限公司 北京市海淀区学院南路12号北师大留学生创业园57号楼301室 QQ:944823743，449730601（销售），948393554（技术）， 电话： 010010销售）技术），order@ 产品及特点 端粒酶存在于85-90%的肿瘤组织中，因此通过检测端粒酶活性就能早期诊断大多数肿瘤。目前最常用的检测端粒酶活性的方法就是TRAP (telomeric repeat amplification protocol，端粒重复片段扩增)，它利用端粒酶能在底物DNA末端添加不同数量的TTAGGG序列这一特点，通过PCR检测延伸产物而高效检测端粒酶活性。本产品是北京天恩泽在经典TRAP技术基础上改良而得，专门用于快速测定人类细胞端粒酶活性。它具有以下特征： 一站式，提供从细胞裂解到PCR的所有试剂，但不含PAGE和银染试剂。 一管式操作，端粒酶延伸和PCR在同一体系中完成，方便快捷。 提供改进的、长为150 bp的内参和含8个端粒序列的合成端粒，可有效排除PCR假阴性。内参长度远大于TRAP产物，不会干扰结果分析。 改良的TS模板和PCR引物，极大降低了引物二聚体的形成。 既可用于培养细胞，也可用于实体组织。 灵敏度高，最低可以检测到10个肿瘤细胞中的端粒酶活性。 规格及成分 成 份 编 号 50次塑料袋包装 TRAP细胞裂解液 111009A 10 mL PCR Mix 3.0 90805 1.5 mL 合成端粒(PC) 111009B 50 uL TS-引物混合物（含内参） 111009C 300 uL 超纯水 100935 1 mL 使用手册 1份 运输及保存 低温运输，-20℃保存，有效期一年。 自备试剂 PAGE电泳及银染试剂盒 使用方法 一：端粒酶的提取 注意：端粒酶的组成成分中有RNA，极容易被降解，因此，应该跟提取RNA一样，尽量在低温条件下快速操作、必须使用RNase-free的耗材、桌面最好用固相RNase清除剂清洁（CAT#:3090）清洁。 对冷冻的实体组织：将50-100 mg冷冻组织在液氮中用预冷的研磨器研磨成粉末，再转移到预冷的玻璃匀浆器中，加入200 uL 预冷的TRAP细胞裂解液，温和手动匀浆数次后冰浴30分钟，每间隔数分钟涡旋振荡一次，共5-6 次，然后直接进入第3步操作。为保证裂解效果，可在显微镜下观察。如果组织样品不足50-100 mg，可以按比例降低TRAP细胞裂解液的用量。 对新鲜的培养细胞和组织：用自备的预冷PBS洗涤105-106个经过胰酶处理的细胞或50-100 mg新鲜组织，3000 g 4℃离心5分钟，弃上清；加入200 μL预冷的TRAP细胞裂解液悬浮细胞或组织。对细胞：涡旋振荡10秒后置冰浴30分钟，每间隔数分钟涡旋振荡一次，共5-6 次。对组织：在冰上用玻璃匀浆器轻柔匀浆后冰浴30分钟，每间隔数分钟涡旋振荡一次，共5-6 次。如果细胞不足1×106或50-100 mg，可按比例降低TRAP裂解液的用量。 12000-14000 g 4℃离心20分钟。 收集160 uL上清，先取部分用于测定蛋白质浓度，可通过测定A215和A225得到，计算公式是蛋白质浓度（ug/uL）=0.144×（A215-A225）×稀释倍数，也可使用BCA法测定蛋白浓度。本试剂盒制备的细胞裂解物的蛋白浓度一般在10-750 ng/uL。知道各样品的蛋白浓度后，可用TRAP细胞裂解液将各样品的蛋白浓度调成一样，然后按10 μL/管分装得到至少15管裂解物，放-80℃冷冻保存（可存放一年）。每个样品可取一管进行热灭活（95℃处理10分钟）后再放-80℃冷冻保存，此管将作为该样品的样品对照。如有必要，可以根据起始细胞或实体组织用量和最终蛋白量计算出每ug蛋白所对应的细胞数或实体组织mg数。 二：TRAP反应 确定每个样品的用量：可以按每个反应加入相同的细胞裂解物ug数或其所对应的细胞数或实体组织mg数来设置TRAP反应，为便于分析比较，每个TRAP反应所用的蛋白量（或细胞数）必须一样。由于裂解物中一般都有高浓度的不明Taq DNA聚合酶抑制物（TRAP失败最常见的原因），因此最佳结果往往是在稀释10-1000倍后得到。如果需要稀释，每个样品的稀释度也需要保持一致。 在PCR管中设置TRAP反应（50 uL反应体系，以N个样品、N个