【2017年整理】以动物细胞系统大量制造活性蛋白质.docx

第十一章 以动物细胞系统大量制造活性蛋白质 Preparation of Large-scale Active Proteins Using Animal Cell Culture System 吴 灿 辉 环球基因生物科技股份有限公司 研发生产部 经理 一, 前言 动物细胞培养技术很早即建立,初期常因微生物的污染受困扰,至1913年Carrel将外科无菌操作技术应用在动物细胞培养上,细胞始能长期培养而不受污染.1916年Rous及Jones利用胰蛋白(trypsin)由组织中分解细胞,发展出附著性细胞的次培养法(subculture).在1948~1952期间,mouse纤维母细胞(fibroblast)和HeLa两种细胞株先后被Earle与Gey等学者建立.1955年Eagle开发生化学配方培养液(chemical defined medium),使得细胞培养不必再依赖体液培养.配合分子生物与生物科技技术的进展,1975年Kohler和Milstein研发出融合瘤(hybridoma)技术,之后被广用於单株抗体的制备.80年代第一个由动物细胞制造的重组蛋白组织胞浆素原激活(tissue plasminogen activator; t-PA)由美国Genentech 公司以中国仓鼠卵巢细胞(Chinese hamster ovary cell,CHO)正式生产. 在培养角瓶(T-flask)进行的小量细胞培养是确立一株新细胞或用以研究细胞形态及比较不同试剂对细胞生长与代谢之影响的最佳细胞培养方式.但是有愈来愈多的应用需要使用大量的动物细胞,例如:萃取细胞组成份(如109细胞可以提供 7 mg DNA);使用大量细胞培养病毒以制备疫苗(一般每批次使用5x1010细胞);以及许多医药用重组蛋白制剂之生产,如干扰素(interferon),红血球生成素(erythropoietin),胞浆素原激活,酵素,贺尔蒙,快速检验试剂与抗体,规模达到10,000 L之动物细胞培养在生物科技产业制造过程已被广泛使用.这方面的进展已由昂贵,花费人力提升至大规模的单元操作系统(unit process system).虽然单元操作系统可以节省成本且更有效果,但是将其使用於细胞培养放大生产仍需一系列的修改以克服一些大量生产的限制因子,例如氧气限制,剪力伤害(shear damage),养分的供给以及大量新陈代谢产物的生成与排除,在本章以下的内容将针对这些大量生产的限制因子提出讨论. 以动物细胞做为生产活性蛋白的一个重要考量点在於动物细胞合成的蛋白质可正确折叠(folding)形成四级结构且蛋白质释放出细胞之前会进行一系列转译后修饰作用158 (post-translational modification),其中最重要的是醣化作用(glycosylation),醣化作用对蛋白的生物活性表现以及在人体中代谢速率有极大影响性,所以现在表现医疗用活性蛋白常使用动物细胞为宿主.目前动物细胞可依其性质,形态及培养特质来分类,以其性质来分有初代细胞(primary cell),正常细胞(normal cell)及持续性细胞株(continuous cell line)三种.初代细胞是直接以胰蛋白将动物组织或器官加以分解而得;正常细胞是指具成对染色体,培养时须有培养表面供其附著,单层长满后即不再继续增生,可用胰蛋白让这些细胞脱离附著面进行继代培养,但无法永续地培养,有一定生长代数.相反地,细胞株则可持续地培养.生物蛋白制剂生产所使用的细胞依其形态则可分类为纤维状(fibroblast-like)及表皮状(epithelial-like)两种不同的细胞.若以培养时是否需要附著面,又可分为悬浮性(suspension)及附著性(adherent)两种细胞.悬浮式细胞培养是一种最易於放大生产培养的方式,因为1 L培养槽在概念上与1000 L培养槽是相似的,只是对於环境控制及维持细胞生长之正确生理环境需要较多的考量.附著性细胞培养因受到培养表面与氧气营养供给问题,较不容易以单一培养槽体放大培养生产,须有周边配备协助,但是近年来的一些改良设备已有突破性的进展,在本章后半段将会进一步探讨. 二, 影响大量细胞培养之参数 1. 培养容器与培养表面 最标准非抛弃式动物培养细胞容器是玻璃制品,在大量培养中则以不锈钢制品取代.细胞通常易於贴附於玻璃表面,如有需要可以先处理过玻璃以提高细胞贴壁效果.在悬浮式细胞培养,细胞通常不需要细胞贴壁,而且玻璃培养容器须以矽胶(silicone)处理培养表面,通常使用的有:Sigmacote (Sigma-Aldrich),Dow Corning