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PAGE PAGE 8 第二十二章 免疫学检测技术的基本原理 第一节 体外抗原抗体结合反应的特点及影响因素 （一）抗原抗体反应特点 1．高度特异性 抗原与抗体的结合具有高度特异性，这种特异性是由抗原表位与抗体分子中的超变区互补结合所决定的。空间构型互补程度越高，抗原表位与抗体可变（V）区之间结合力越强，抗原抗体结合的特异性越强，亲和力也越高。利用这一特点，在体外可以对许多未知的生物学物质进行特异性鉴定。如利用抗伤寒杆菌的抗体检测伤寒杆菌；也可用已知的抗原（如乙型肝炎病毒）来检测相应的抗体（抗乙型肝炎病毒抗体）。 2．表面化学基团之间的可逆结合 抗原抗体结合除了空间构象互补外，主要以氢键、静电引力、范德华力和疏水键等分子表面的化学基团之间的非共价方式结合。这种非共价键不如共价键结合稳定，易受温度、酸碱度和离子强度的影响而解离，解离后抗原和抗体仍具有原有的特性。解离度主要取决于两个方面：一是抗体与抗原结合的亲和力（affinity）。亲和力指抗体分子单一抗原结合部位与一个相应抗原表位之间互补结合的强度。抗体亲和力越高，解离度越低；反之抗体的亲和力越低，解离度越高。二是抗原抗体反应的环境因素如温度、酸碱度和离子强度。因此在体外进行抗原抗体反应时，要求适当的温度、酸碱度和离子强度等条件。 3．适宜的抗原抗体浓度和比例 抗原抗体结合后能否出现肉眼可见的反应取决于两者适当的浓度和比例。在反应体系中，如果抗原与抗体的浓度和比例适当则抗原抗体复合物体积大、数量多，出现肉眼可见的反应。若抗原或抗体过剩，抗原-抗体复合物体积小、数量少，不能出现肉眼可见的反应。故在具体实验过程中要适当稀释抗原或抗体，以调整两者浓度和比例，使其出现最大复合物，避免假阴性的发生。 4．抗原抗体反应的两个阶段 抗原抗体反应可分为两个阶段：第一个阶段是抗原抗体特异性结合阶段。抗原分子与抗体分子之间是互补的非共价结合，该反应迅速，可在数秒钟至几分钟内完成，一般不出现肉眼可见的反应。第二阶段为可见反应阶段，是小的抗原抗体复合物之间靠正、负电荷吸引形成较大复合物的过程。此阶段所需时间从数分、数小时至数日不等，且易受电解质、温度和酸碱度等条件的影响。 （二）抗原抗体反应的影响因素 1．电解质 抗原、抗体通常为蛋白质分子，等电点分别为pH3~5和5~6不等，在中性或弱碱性条件下，表面带有较多的负电荷，适当浓度的电解质会使他们失去一部分的负电荷而相互结合，出现肉眼可见的凝集团块或沉淀物。实验中常用0.85%的NaCl或其他离子溶液作稀释液，以提供适当浓度的电解质。 2．温度 适当提高反应的温度可增加抗原与抗体分子的碰撞机会，加速抗原抗体复合物的形成。在一定范围内，温度越高，形成可见反应的速度越快。但温度过高（56℃以上），可使抗原或抗体变性失活，影响实验结果。通常37 3．酸碱度 抗原抗体反应的最适pH在6~8之间，pH过高或过低，均可直接影响抗原、抗体的理化性质。此外，当抗原抗体反应液的pH接近抗原或抗体的等电点时，抗原抗体所带正、负电荷相等，由于自身吸引而出现凝集，导致非特异性反应，即假阳性反应。 第二节 检测抗原和抗体的体外试验 抗原和其相应抗体在体外相遇可发生特异性结合，由于该反应是高度特异性的，因此可以用已知的抗原（或抗体）来检测未知的抗体（或抗原）。由于抗原物理性状的差异或参加反应的其他辅助成分的不同，可出现不同类型的反应。如凝集反应、沉淀反应、中和反应及免疫标记技术等。实验所采用的抗体常存在于血清中（还可存在于关节液、脑脊液、腹水及胸水中），因此习惯上将体外的抗原-抗体反应称之为血清学反应（serological reaction）或血清学试验。 1．凝集反应（agglutination reactions）： 细菌、细胞等颗粒性抗原或表面包被抗原的颗粒状物质（如聚苯乙稀乳胶等）与相应的抗体在电解质存在的条件下结合，出现肉眼可见的凝集团现象，称为凝集反应。凝集反应分为直接凝集反应和间接凝集反应两种。 （1）直接凝集反应（direct agglutination reactions）：颗粒性抗原本身直接与相应的抗体反应出现的凝集现象，如红细胞凝集或细菌凝集。 （2）间接凝集反应（indirect agglutination reactions）：将可溶性抗原或抗体先吸附在某些颗粒载体上，形成致敏颗粒，然后再与相应抗体或抗原进行反应产生的凝集现象，称为间接凝集反应。 直接凝集反应和间接凝集反应亦常用于溶血性疾病的诊断，如Rh血型不符的新生儿溶血症及药物相关的溶血性疾病。 2．沉淀反应（precipitation reactions）： 毒素、组织浸液及血清中的蛋白等可溶性抗原与相应抗体反应后，出现肉眼可见的沉淀物，称为沉淀反应。 3．免疫标记技