荧光定量PCR技术临床应用__培训课件.ppt

全血 以全血作为待测标本时,必须注意抗凝剂的选择,一般使用EDTA-Na2或枸椽酸钠,不可使用肝素 全血样本如用于DNA提取检测,可4℃下短期保存,如用于RNA检测，则应在取血后，尽快提取RNA 外周血单个核细胞 外周血单个核细胞可从抗凝全血制备，主要有两条途径，一是使用淋巴细胞分离液分离制备；二是使用红细胞裂解液,裂解全血中的红细胞,经生理盐水数次洗涤,即可得到单个核细胞 外周血单个核细胞如暂不提取核酸,可保存于-70℃下 痰 痰属于分泌物,临床上常用作为结核杆菌DNA测定标本 痰标本中含有大量粘蛋白和杂质,故在核酸提取时,需对样本进行初步处理，即用1 mol/L NaOH或变性剂液化 如用于非结核杆菌如肺炎支原体的PCR检测，痰标本只能室温悬浮于生理盐水中，充分振荡混匀，促使大块粘状物下沉，取上清离心，所得到的沉淀物即可用于核酸提取。 液化标本如不立即用于核酸提取,可保存于-70℃下 棉拭子 在使用PCR方法检测性病病原体时,临床标本一般为棉拭子,可将棉拭子置于适量生理盐水中,充分震荡洗涤后,室温静置5～10分钟,待大块状物下沉后,取上清立即离心,其后的沉淀即可用于DNA提取。 如不立即用于核酸提取,则需保存于-70℃下. 脓液 脓液的处理依情况而定,如用于分枝杆菌(如结核杆菌)核酸测定的标本,粘稠的脓液可采用痰标本的处理模式，先进行液化，再离心取沉淀提取DNA；水样的脓液则直接离心,沉淀用生理盐水洗2～3次后,即可用于DNA提取 对于用于非分枝杆菌测定的脓液标本,如过于粘稠,则加入适量生理盐水,充分振荡后,静置,取上清立即离心,沉淀用于DNA提取;如为水样,则按上述直接离心取沉淀即可。 沉淀标本的保存条件同样为-70℃ 体液 临床体液标本包括胸水,腹水,脑脊液,尿液等,可按水样标本的方式离心取沉淀后,提取核酸。沉淀样本的保存同上。 乳汁 乳汁有时也可作为标本，如乳汁中HBV DNA、HCV RNA、结核分枝杆菌和布鲁氏菌等的PCR检测。 提取方法：乳汁标本置4℃冰箱过夜→取100ul中清液→ 10000rpm/min离心10分钟→尽可能去除奶酪（建议用棉签蘸去）→弃上清加50ulDNA提取液→沸水浴10分钟→10000rpm/min离心5分钟→取5ul上清点样扩增。 组织 组织有新鲜组织块和石蜡切片。新鲜组织块的处理步聚首先用生理盐水洗两次,然后将其捣碎或切碎，加入生理盐水后剧烈震荡混匀,离心，弃上清，再用蛋白酶K消化后提取核酸。新鲜组织最好是保存于50%乙醇中,具体作法是，先用生理盐水将组织洗一次,切成宽度小于1cm的小片,加入适量的生理盐水,然后,边摇边加入无水乙醇至终浓度为50%.这样固定的组织标本室温下可保存数日,4℃可保存6年。 石蜡切片用于核酸提取,需先用辛烷或二甲苯脱蜡,再用蛋白酶K消化后即可进行DNA提取 临床标本中PCR反应抑制物 内源性的 :免疫球蛋白、蛋白酶、血红素及其代谢产物、白细胞内的乳铁蛋白、肌红蛋白、脂类、粘蛋白、尿素、离子、胆盐、多糖等。 外源性的 :如肝素抗凝剂、纤维素和硝酸纤维素、过度UV照射后的矿物油、手套滑石粉、标本容器或采样器材上含有的抑制物。 常见的核酸提取方法 煮沸法 柱提取 磁珠法 一步法 二步法 裂解方法 煮沸 煮沸 化学裂解 化学裂解 分离方法 离心 离心 亲和吸附 吸附或杂交 步骤 煮沸裂解 离心，去除大分子的抑制物 取上清扩增 煮沸裂解 离心弃上清，浓缩标本并去除小分子抑制物 离心，取上清扩增，去除大分子抑制物。 化学裂解 过柱吸附 洗涤 洗脱 取洗脱液扩增 化学裂解 加磁珠吸附 洗涤 洗脱 取洗脱液扩增 抗干扰能力 差 较差 好 最好 提取物组分 较小分子量的混合物 与核酸相似分子量的混合物 全核酸 特定病原的核酸 自动化程度 手工 手工 手工或自动 半自动或全自动 RNA提取的独特性 临床标本及实验室环境中,存在大量对RNA具有强烈降解作用的RNase，而RNase较耐高温,不易失活。 如何避免RNase对标本的污染及防止RNase对提取的RNA的降解,是保证RNA成功提取的关键之所在。 RNA提取所用器皿的处理 经高压灭菌的一次性使用的塑料制品如试管,离心管等基本上无RNase,可以不经预处理直接用于制备和贮存RNA。 实验室用的普通玻璃器皿经常有RNase污染,使用前必须于180℃干烤8小时以上,或用0.1%焦碳酸二乙酯(DEPC)的水溶液浸泡用于制备RNA的烧杯,试管和其它用品。 DEPC是RNase的强烈抑制剂。灌满DEPC的器皿于37℃下放置2小时，然后用灭菌水淋洗数次，并于100℃干烤15分钟，最后高压蒸汽下15分钟。上述处理可除去器皿上痕量的DEPC,以防DEPC通过羧甲基化作用对RNA的嘌呤碱基